第一类群体的遗传清晰度新策略芽孢杆菌利用编码丝氨酸样酶的纤溶酶基因从发酵食品和饮料中分离出的物种

摘要

纤溶酶基因(fibE)是普遍保守的芽孢杆菌属于第一类物种。这是对细胞外介质中分泌的丝氨酸样酶(FibE)的编码。本研究的目的是评估这个新的保守的家务管理基因在I群中的分子效用芽孢杆菌对刚果共和国传统发酵食品和饮料中的一些相关菌株进行鉴定和鉴别。首先，用酪蛋白溶酶法筛选155株分离物的酶活性。PCR技术和巢式PCR方法使用特异性引物和相关16S RNA测序。Blotting技术与分子方法进行了深入的比较。结果是B.解淀粉素(1)，B.地衣(1)，B.枯草菌(1)，B.短小(3)，b . altitudinis(2),B. atrophaeus (1),B. safensis (3)已在发酵食品和饮料中发现的155株分离菌中进行了专门鉴定。与纤维be成熟蛋白融合的谷胱甘肽s -转移酶(GSTs)的基因分析及过表达大肠杆菌BL21和TOP10的酶活性比FibE野生型高2倍。免疫检测应该是相关的，但这没有明显的区别芽孢杆菌属于第一组。

1.介绍

从刚果共和国的北部到南部，发酵食品和饮料种类繁多，确实含有令人印象深刻的微生物多样性。最常见的微生物是菌属芽孢杆菌、乳酸菌、非乳酸菌、霉菌和酵母菌等在本地发酵食品和饮料中发挥重要作用[1- - - - - -4］．芽孢杆菌菌株是一种普遍存在的细菌，它们利用刚果布拉柴维尔发酵食品和饮料的20多种品种，包括“必威2490多巴mbody”这是一种传统食品，通过木薯叶的碱性发酵获得。不仅木薯叶，木薯块茎也可以在三到四天后发酵，产生一种在刚果共和国南部被大量消费的本地产品，称为“木薯”。Bikedi”．成熟的木薯块茎可以与花生糊混合，从而获得Mbala-mpinda”．此外，更受欢迎的饮料是棕榈酒，这是一种酒精饮料，由称为“棕榈”的棕榈树的汁液制成。Samba”．发现的另一种饮料是Loungouila”,甘蔗酒，还有"Mbavu”,当地的香蕉酒。最近的一项研究聚焦于潘德这是一种当地的发酵食品酒椰taedigera(集市)。集市。(1838) (3.- - - - - -5］．属成员芽孢杆菌为棒状孢子形成菌，属厚壁菌门，DNA碱基组成约为50 ~ 54% G+C。此外，在发酵食品和饮料的加工和储存过程中，杆菌更稳定[6]和药物制剂。这些产品已被证明是促进健康配方的合适候选产品[7］．20个完整的分析芽孢杆菌基因组已经被演示和起草。枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，而且b . amyloliquefaciens基于核心基因组，基因组相似性评分(GSS)更具有基因组相关性[8]，以及同源组簇[9］．在同源蛋白的保守区域内插入或删除的保守标记索引[10已经被用来歧视硅片芽孢杆菌已经描述了几种方法来分割它芽孢杆菌根据生物化学、生活方式和/或在不同基质上的生长情况分组[9］．芽孢杆菌根据其与16S rRNA基因序列相似性相关的高水平系统发育或表型特征，spp.可分为9个类群(类群I-IX)。枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，解淀粉B.， altitudinis, mojavensis，B. safensis, B. circulans，而且b . atrophaeus属于第一类[10，11］．有趣的是，上述细菌大多是亲缘关系物种，并具有非常高水平的16S rRNA基因序列相似性枯草芽孢杆菌尽管与后者的DNA-DNA杂交值低于70% [12］．此外，很少有分子区分、表型或生物化学特征可以发现这些物种之间的区别。

有时属芽孢杆菌是一种系统发育上不连贯的分类单元，群中的成员缺乏共同的进化物质[10］．在这种情况下，必须使用遗传鉴别。包括16S rRNA基因在内的一些对细胞生存起着重要作用的原核管家基因已被用于细菌的鉴别。管家基因在分子上对评估一个快速和可靠的结果密切相关的鉴定是重要的芽孢杆菌菌株。在家务管理基因中rpoB,gyrB,nifD,矩形一个,三磷酸腺苷D是被引用最多的。13，14］．就多位点序列分型而言，这些被认为是最明智的选择[13］．16S rRNA基因高度保守，是细菌分类学的重要标准[15］．16S rRNA基因的部分测序也被用于快速鉴定芽孢杆菌细菌(16］．然而，这一标准对于某些物种似乎是不够的[17］．事实上，对密切相关的细菌种类进行分类有时似乎很困难[18］．已有研究表明，16S rRNA基因可以偶尔转移或横向重组[19］．使用16S rRNA基因的另一个缺点是，该基因的拷贝数量经常是可变的。有些物种的基因组中可能有1至15个核糖体操纵子[20.]，它不允许对该物种进行定量研究。

细菌属于芽孢杆菌第一组[11),包括枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，B. amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. safensis, B. altitudinis，而且b . atrophaeusHarbor是一种极度保守的基因，编码“所谓的”纤溶酶(fibE)，一种类似丝氨酸的酶。这种酶应该在心血管疾病的治疗中发挥主要作用。该基因的同源物已被分离出来。枯草芽孢杆菌产纳豆激酶(NK)已从一种日本大豆发酵食品中分离出来[21］．b . amyloliquefaciensCH5,b . amyloliquefaciensDC-4,芽孢杆菌sp. CK从发酵大豆中分离得到[22- - - - - -25］．b . amyloliquefaciensNM76能产生一种具有高纤溶活性的酶，从刚果共和国的一种发酵食品Ntoba Mbodi中分离得到[26］．在NCBI数据库中fibE吉恩的名字是根据芽孢杆菌物种。这被称为肽酶S8b、3-19 [27),b . safensisJPL_MERTA8-2 [28]，而在b . mojavensis，该基因的产物A21被命名为subtilisin BM1，该基因被命名为subtilisin BM14月E在地衣芽。F5。在这项工作中，这个基因已经被提名fibE(纤溶酶基因)。该基因的产物被编码为前原蛋白(28kDa)。该前序列对应于SEC通路的信号序列，其特征基序AXA可被信号肽酶切割[29］．前序列是蛋白质成熟过程中被裂解的序列[30.］．可裂解基序对应的基因大小根据物种的不同约为850 bp。必威2490该基因在第I组中高度保守芽孢杆菌它的序列同源性接近90%作为这项工作的一部分，我们针对该基因在包括AQSV氨基酸在内的成熟蛋白质起始点的核苷酸变异性。我们专注于一些重要的故障排除，以确定物种的复杂性芽孢杆菌属于第一组的。

2.材料与方法

2.1.菌株的分离与鉴定

从发酵食品、饮料、土壤和孔雀鱼肠子中各取10g样品无菌取样于无菌猎鹰管中。用无菌水将样品均质，分散在十支无菌管中。在添加4.2 mL多粘菌素b的莫塞尔琼脂培养基上进行稀释，并将菌悬液条纹化。在同一培养基上重复进行3次菌落计数。在37°C孵育24小时至48°C。用显微镜进行形态表征，用3% KOH确定革兰氏状态。产孢，过氧化氢(H₂O₂)和氧化酶试验用于生化表征。

2.2.酶的活动

以便在属水平上进行区分芽孢杆菌用酪蛋白作为底物对菌株进行酶活性测定。简单地称取1克琼脂糖与100毫升PBS混合。混合物在微波炉中加热3分钟，直到琼脂糖完全溶解，然后在40°C的水浴中冷却。然后在混合物中加入10毫升脱脂牛奶。均质后，将混合物倒入培养皿中。一旦凝固，孔被小心地无菌生成到凝胶中。首先在37°C搅拌下开始过夜培养。然后培养液以6000转/分离心10分钟μ将上清液的L沉积在由1%琼脂糖凝胶、0.01 M PBS、pH 7.4和脱脂牛奶组成的琼脂培养基上的孔中。培养皿在37°C下孵育24小时。酪蛋白水解活性的存在可以通过菌落周围的一个明确的晕来检测，表明酪蛋白水解。测量了光晕直径。

2.3.基因组DNA提取、测序和DNA技术鉴定

为了利用DNA技术直接对分离株进行鉴定fibE在美国国家生物技术信息中心发现了编码纤溶酶的基因。http://www.ncbi.gov/Blast.cgi)的基因组数据库的目标菌株b . amyloliquefaciens，B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. altitudinis, B. mojavensis, B. safensis，而且b . atrophaeus．应用pDRAW32软件进行生物信息分析。从成熟蛋白中严格选择引物，使用嵌套PCR法的内部引物，生成461 pb扩增子(表1)．根据NucleoSpin微生物DNA (machery - nagel)试剂盒进行分离基因组DNA的提取和纯化。简单地说，分离株在5 mL LB肉汤中生长24小时，在37°C搅拌。用琼脂糖凝胶电泳和260/280 nm光密度比测定DNA纯度。PCR产物已经测序。通过使用通用引物16 s rRNAfD1 (5 ' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 ')和rP2 (5 ' - ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3 ')已进行分离株的确认。5μ将每个扩增产物的L与2μ负载缓冲液(BIOKE)的L。混合物在1%琼脂糖凝胶(w/v)上进行电泳。采用10kb 2-Log (BIOKE)作为分子量标记。PCR产物用凝胶提取试剂盒(Omega Bio-tek)的溶液进行纯化，纯化产物用Sanger技术(3130xl Genetic Analyzer, Applied Biosystems)进行测序。获得的序列与软件Bio Numerics 7.5(应用数学，比利时)进行比对，并手动修正，以解决义链和反义链之间的差异。基于Drancourt发表的识别标准，通过NCBI门户，使用BLASTn程序将序列与序列数据库中包含的同源序列进行比较[31］．

2.4.重组蛋白质粒的构建与表达

用于结构的底漆列于表中2表中的质粒3.．在用DNA技术在物种层面上鉴定菌株后，所有的撒小谎E片段扩增自芽孢杆菌基因组DNA。PCR片段用OneTaq DNA聚合酶(Bioke)扩增，插入镜框销售税在pGEX-4T-1消化Bam你好,生态基因的RI扩增自b . amyloliquefaciens，b、，b . mojavensis，枯草芽孢杆菌，b . atrophaeu年代,B. altitudinis, Bam你好,Xho我为地衣芽。,生态R1和Xho1b . safensis(见表3.)．得到的质粒命名为pSNZ1, pDOK2, pDOK2, pdo3, pdo5, pdo6, pdo7, pdo8和pdo93.)．所有结构均通过DNA测序随机检查。大肠杆菌菌株BL21和TOP10，含有pGEX-4T-1或其衍生物(见表3.)表达来自I组不同菌株的GST-FibE芽孢杆菌在LB肉汤中培养100μg/mL氨苄西林在37°C作用2 h，然后加入IPTG至终浓度为0.1 mM，在30°C孵育3 h后，收获细菌，按照谷胱甘肽Sepharose 4B制造商(Amersham Pharmacia Biotech)的描述纯化GST融合蛋白。用SDS-PAGE和考马斯蓝检测蛋白质的合成和纯化。用抗gst抗体(GE Healthcare)进行免疫印迹分析纯化的蛋白质。然后用50的体积来评估酶活性μ上清液的L大肠杆菌TOP10和BL21与pGEX-4T-1或其衍生物。测定酶活性清区直径。

2.5.多克隆抗体的产生和芽孢杆菌的免疫检测

多克隆抗体由5周龄雌性无特异性病原体BALB/c小鼠制备。10μ第一周注射GST-FibE衍生物naïve BALB/c小鼠。两周后进行腹腔内注射以诱导抗体的产生。以GST-FibE-Bs、GST-FibE-Ba、GST-FibE-Bl、GST-FibE-Bp、GST-FibE-Bsa、GST-FibE-Bat和GST-FibE-Bal等融合蛋白的纯化变种为研究对象，对其粗提物和培养上清进行了筛选大肠杆菌仅生产GST的TOP10。使用LB培养基过夜纯培养B.解淀粉酶，B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. mojavensis, B. safensis, B. atrophaeus，而且b . altitudinis已执行。上清液与80% NH4SO4在+4℃下混合。培养物以6000转/分离心，时间1小时。用500收集颗粒μPBS的L。用考马斯蓝SDS-PAGE染色，用抗fibe变异体多克隆抗体进行免疫检测。

3.结果

3.1.细菌隔离

经Mossel培养基培养、宏观分析、显微分析(革兰氏阳性杆菌)、3% KOH革兰氏阳性菌、孢子形成菌试验、过氧化氢酶反应阳性等合格评价，可将工作菌分类为芽孢杆菌属。从不同原料棕榈酒(30株)、Ntoba Mbodi(21株)、Mbala-mpinda(19株)、Pandé(12株)、香蕉(35株)、甘蔗酒(13株)、土壤(15株)和古比鱼肠(10株)中分离得到155株纯培养菌株。所有细菌均为产孢菌落，过氧化氢酶阳性，革兰氏阳性。容易歧视芽孢杆菌在属水平上，对纯培养的菌株进行了产酪蛋白水解蛋白酶能力的评估。清晰的光晕显示活性，没有清晰的光晕意味着酪蛋白溶解活性的缺失。具有酶活性的菌株比例为:棕榈酒(56%)、Ntoba Mbodi(47%)、Mbala-mpinda(63%)、Pandé(33%)、香蕉酒(54%)、甘蔗酒(69%)、土壤(73%)和古比鱼肠道(80%)。

3.2.直接放大fibE基因

通过直接瞄准进行物种级别的鉴定fibE基因扩增芽孢杆菌在155株分离菌中，随机选取了73%能够降解酪蛋白的细菌。利用针对该成熟蛋白编码序列的引物共进行了720个PCR反应(图1(一))包括Ba. idma - f /Ba。IdMa-R (b . amyloliquefaciens), Bl.Id.Ma-F / Bl.Id。ma r (地衣芽。), Bs.Id.Ma-F / Bs.Id。ma r (枯草芽孢杆菌), Bp.Id.Ma-F / Bp.Id。ma r (b、), Bm.Id.Ma-F / Bm.Id。ma r (b . mojavensis)和Bsa.Id. ma - f /Bsa.Id. b。ma r (b . safensis)．在155株纯培养菌株中，扩增出12个PCR阳性片段。结果，一株b . amyloliquefaciens，其中之一地衣芽。，其中之一枯草芽孢杆菌，三个b、，三个b . safensis之一b . altitudinis之一b . atrophaeus还有三个b、(图1 (b))．没有片段被放大b . mojavensis．

此外，通过使用Ba. shma - f /Ba。SHMa-R Bl.SHMa-F /提单。SHMa-R Bs.SHMa-F / Bs。SHMa-R Bp.SHMa-F / Bp。SHMa-R Bm.SHMa-F / Bm。SHMa-R,Bsa。SHMa-F/Bsa。SHMa-R引物中对应461 pb的内部片段被特异性扩增，包括b . mojavensis(图1 (c))．mojavensis已经通过直接使用基因组DNA进行了扩增(图5)1 (c))．对11个成熟的PCR产物进行测序fibENCBI分析和片段分析显示，与目标菌株的符合率为100%。为了确保这些菌株是好的菌株，用16S核糖体RNA基因进行更多的平行确认．16S核糖体RNA序列已在GenBank中提交。已报告的身份比率(表4)．

3.3.在大肠杆菌BL21和TOP10中的表达

整个fibE包含七个菌株的前序列和前序列产物的基因芽孢杆菌以载体pGEX-4T-1在框架内克隆，表达为大肠杆菌菌株BL21和TOP10。纯化融合到重组丝氨酸样酶的GST表明融合已被裂解(数据未显示)。然后将AQSVPY肽段的成熟序列与GST融合。融合蛋白的分子量均为52kDa芽孢杆菌种虫害包括解淀粉B. licheniformis，枯草B. pumilus, safensis, atrophaus，而且b . altitudinis(图2:最高)。利用单克隆抗gst，融合蛋白被鉴定(图2:底部)。

很容易描述fibE构建了pGEX-4T-1及其衍生物，以评估融合重组FibE蛋白的表达是否具有与野生型相同的特征。的大肠杆菌转化物包括TOP10组(KE1、KE2、KE3、KE4、KE6、KE7、KE8;见表3.)和BL21组(QEK1, QEK2, QEK3, QEK4, QEK6, QEK7，和QEK8;见表3.)显示出较高的酶活性芽孢杆菌spp。(图3.)．它是从含有pGEX-4T-1及其衍生物的诱导细胞的可溶性裂解液中完成的。活性比野生型高2倍(图4)．

3.4.FibE的免疫检测

为了比较多克隆抗体和遗传扩增，我们用BALB/c小鼠产生了GST-FibE衍生物的抗体，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、高培木芽孢杆菌、safensis、而且b . atrophaeus．免疫印迹的α-FibE-Bs,α-FibE-Ba,α-FibE-Bl,α-FibE-Bsa,α- fiber - bat实验表明，每种抗体都能很容易地识别随机选择的分泌蛋白芽孢杆菌野生型属于i组。所有多克隆抗体都能检测野生型分泌的蛋白b . mojavensis除了α-FibE-Bsa。α-纤维- bp不能识别分泌的蛋白质地衣芽。．α-FibE-Bsa检测不到b . atrophaeus，b . safensis,b、(图4)．

4.讨论

本工作旨在以更便宜的设备和更快的方法鉴定属于系统发育类群的芽孢杆菌[11[同一起B.解淀粉酶，B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. mojavensis, B. safensis, B. atrophaeus，而且altitudinis。对155株菌株的表型和生化特征进行了相关分析和定位芽孢杆菌属。刚果共和国拥有几种含有不明微生物的发酵食品和饮料。七个样本，包括当地发酵食品(桑巴，Ntoba Mbodi, Pandé， Loungouila和Mbala-mpinda)，土壤和孔雀鱼肠[32]被用来分离这些细菌。属芽孢杆菌可与Ntoba Mbodi一起从不同发酵食品中分离出来[5， Mbala-mpinda, Pandé，香蕉酒(mbavu)和甘蔗酒(Loungouila)，但也有来自其他不同环境的葡萄酒，如岩石、土壤、水生环境和各种昆虫和动物的肠道[33］．属芽孢杆菌也因其产生细胞外蛋白酶的能力而闻名。在这项工作中，我们已经表明，在155个分离菌中，73%的特征菌具有蛋白水解活性。酪蛋白降解光晕的直径在1.5±0.05 cm到2.7±0.03 cm之间。如果分离株不降解酪蛋白，这并不一定意味着它们没有分泌蛋白酶;每种物质都有降解某一特定类型大分子的最佳温度[26］．表型检测仅集中在属水平。在这项工作中，没有根据微生物学经典试验确定的物种。这些方法在微生物鉴定方面存在一定的局限性。近亲物种，如b、而且b . safensis在生物化学上很难区分。这些细菌具有接近99至100%的强烈同源性[34］．显然，使用分子鉴定方法有更多的优点。这些方法更可靠[35，而不是传统的。这里，我们利用了的多态性fibE基因。通过瞄准新一代高度保守的基因，我们证明了b、(3),b . amyloliquefaciens(1),地衣芽。(1),枯草芽孢杆菌(1),b . safensis(3),b . altitudinis(2)b . atrophaeus都被放大了。该扩增产物的琼脂糖凝胶电泳清晰显示约850 bp和450 bp的条带为内序列，与硅片研究中扩增产物的大小一致。必威2490放大fibE-Bm基因利用b . mojavensis-特异性寡核苷酸在850 bp时为阴性，在450 bp时为阳性b . mojavensis基因组的暗示。b . mojavensis已在很大程度上通过多种环境隔离，如海水[36，但也来自土壤和植物[37］．先前的研究表明芽孢杆菌属于I类的物种可能有多个编码纤溶酶的基因拷贝。一对引物可以扩增不同品种的不同大小的纤溶基因芽孢杆菌，但这些菌株必须有高度可变的区域来扩增这些引物[26］．在这项工作中，我们只能放大一个波段。这可以证明该方法的可靠性。这里的策略允许我们以一种非常可靠和具体的方式来识别物种，因为，与通常用于识别这些物种的管家基因不同，本研究中使用的序列是针对一个包含非常多样化的简并密码子的区域。这增加了所使用引物杂交的特异性[38］．

值得记住的是，多态性是由三种类型的DNA序列变异引起的[39］．在我们对齐的“正向”和“反向”寡核苷酸序列中，“单核苷酸多态性(SNPs)”对应于核苷酸替换。正向序列基因分型的内硅分析使得在引物水平(1到28个碱基对)突出核苷酸取代的存在成为可能(图)5)．通过比较选择引物的8株菌株的目标序列，我们发现2、3、4、5、6、8、7、11、17、20和21位置的核苷酸变异从1到23。Bl、Bs、Bp、Ba、Bat、Bs和Bm中鸟嘌呤核苷酸分别被Bal中的胞嘧啶(2GfibE基因(图5)．

与整个序列在框架上构建表明融合蛋白可以很容易地表达大肠杆菌TOP10和BL21。先前的研究表明纤维蛋白溶解酶可以在大肠杆菌［40- - - - - -43］．在这项工作中，我们发现融合到FibE整个蛋白质序列的GST可以很容易地在包含信号肽的序列前区域被切割(数据未显示)。我们发现，与GST融合的成熟序列的蛋白过表达增加了纤维蛋白溶解活性。

纤维be蛋白变体的多克隆抗体能够检测属于的各种纤维be蛋白变体芽孢杆菌第1组预测肽包含6个氨基酸基序(AQSVPY)，为野生型，保守于芽孢杆菌spp.属于i组。这也包括表位S87。这些表位经抗体表位预测(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)使用BepiPred线性表位预测。特别有趣的是，使用PCR扩增和测序的鉴定似乎是在这方面学到的最好的教训芽孢杆菌第一组鉴定。本研究的这一部分在此描述的目的是评估用于检测的遗传鉴别和特异性免疫鉴定试验芽孢杆菌属于第一类，以便开发避免预富集和昂贵设备的技术，以便用于从当地发酵食品和饮料中分离出的微生物鉴定。虽然之前已经证实外膜蛋白多克隆抗体(OMP)来自霍乱弧菌O1很容易被检测到[44]，我们确实认为在基因水平上进行鉴定应该是一个更好的方法，因为FibE蛋白的同源性百分比非常高(70%)，这将为免疫学方法带来更多的困难。

据我们所知，还没有其他研究与鉴别芽孢杆菌属于I组，靶向高度保守的编码纤溶酶的基因。自1987年以来，没有人假设这种基因可以用于歧视芽孢杆菌．这是自纤维蛋白溶解酶发现以来在这方面的第一个策略。然而，一些通过使用特定的感兴趣的基因来直接鉴定菌株的研究也已经完成。细菌，比如b基因可以通过?的序列检测到哭无需测序的基因引物。这些引物特异杂交b基因［45］．利用直接聚合酶链反应的方法，一项酵母研究确定了酿酒arboricola，贝氏S. bayanus, cariocanus，酿酒S. kudriavzevii, mikatae，似氏S. pastorianus通过针对特定基因来识别这些物种[38］．除了弗氏志贺菌而且鼠伤寒沙门氏菌可以很容易地识别，分别针对icsB和invG基因[32］．这些方法对这些菌株的鉴定具有主要和直接的优势。

5.结论

总的来说，这项研究是开发一种容易、快速、可靠的识别新方法的一部分芽孢杆菌属于第一类的细菌。我们进行了分离和表征芽孢杆菌利用经典的微生物学技术和分子生物学技术对不同样品进行分类。我们的新策略，使用一种高度保守的编码纤溶酶的基因，允许我们鉴定分离株，包括B.解淀粉酶，B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. mojavensis, B. atrophaeus, B. altitudinis，而且safensis。这一鉴定是通过16S rRNA基因的扩增和测序并行确认的，该基因被公认为细菌鉴定的标准。该识别策略直接、成本低，具有良好的应用前景。这为各种视角打开了大门，如通过理解群体感应、群体猝灭和发酵过程中的生物膜来评估细胞与细胞之间的相互作用。

数据可用性

包括用于支持本研究结果的数据的Excel表格可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的知识、商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

我们非常感谢Clobite Bouka Biona教授、Anne Botteaux教授和Arsen Lenga教授在发表前的持续鼓励和有帮助的数据分析。

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