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核酸杂志/2019/文章

研究文章|开放获取

体积 2019 |文章的ID 6357609 | https://doi.org/10.1155/2019/6357609

Joseph W. George, Mika Bessho, Tadayoshi Bessho XPF的失活使癌细胞对吉西他滨敏感”,核酸杂志 卷。2019 文章的ID6357609 8 页面 2019 https://doi.org/10.1155/2019/6357609

XPF的失活使癌细胞对吉西他滨敏感

客座编辑:Dongkyoo公园
收到了 9月7日2018
修改后的 2018年12月26日
接受 2月3日2019
发表 3月3日

摘要

吉西他滨(2 ',2 ' -二氟脱氧胞苷;dFdC)是脱氧胞苷类似物,主要用于治疗胰腺癌。吉西他滨的细胞毒性是由于抑制DNA复制。然而,去除合并的dFdC的机制在很大程度上是未知的。在这篇报道中,我们发现核苷酸切除修复蛋白XPF- ercc1参与吉西他滨诱导的DNA损伤修复,XPF失活使细胞对吉西他滨敏感。进一步分析发现,XPF-ERCC1与无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE)共同作用于吉西他滨诱导的DNA损伤的修复。我们的结果证明了评估DNA修复活性在吉西他滨治疗中的重要性。

1.简介

吉西他滨(2 ',2 ' -二氟脱氧胞苷;dFdC)是脱氧胞苷类似物,常用于治疗各种实体肿瘤。特别是,吉西他滨是一种非常重要的胰腺癌化疗药物,因为对于这种致命的癌症,可供选择的药物非常少[1].吉西他滨既可单独使用(单药治疗),也可与伽马射线照射和铂化合物等其他治疗方法联合使用[2].与其他癌症化疗一样,由于对吉西他滨的内在和获得性耐药性,吉西他滨治疗的结果在患者之间存在差异[3.].因此,需要鉴定影响吉西他滨疗效的遗传因素。

吉西他滨的代谢和作用机制已经有了一定的研究[13.].认为吉西他滨的细胞毒性是由于抑制DNA复制。因为吉西他滨是核苷类似物,它需要主动和专门的运输进入细胞。然后,吉西他滨被磷酸化为dFdCTP,可被DNA聚合酶结合,抑制DNA合成。调节这些步骤的任何因素都可能决定吉西他滨的疗效[13.].集中核苷转运体(CNTs)、平衡核苷转运体(ENTs)、脱氧胞苷激酶(dCK)、胸苷激酶2 (TK2)和脱氧胞苷脱氨酶(dCDA)的表达和/或活性水平与吉西他滨细胞毒性的相关性已有报道。这些数据证实,吉西他滨进入细胞的运输效率和吉西他滨磷酸化成dFdCTP的活性是吉西他滨治疗疗效的决定因素。

早期的生化研究显示了吉西他滨诱导的DNA合成抑制的独特特征[4].不同于其他链终止核苷类似物(CTNAs),如araC(阿糖胞苷),ACV(无环鸟苷)和ddC(扎西他滨),它们会阻止下一个进入的dNTP的合并,DNA聚合酶可以从引物端将单个脱氧核苷酸与dFdCMP结合,然后合成被阻止(掩盖链终止)。一旦在复制过程中被DNA聚合酶结合,dFdCMP就会阻止链的延伸。因为dFdCMP对DNA聚合酶的外核溶解校正活性具有抗性[4], dFdCMP位于引物的3 '端附近。因此,吉西他滨诱导的主要DNA损伤将是单链断裂(SSB), dFdCMP位于3 '端或接近3 '端。有趣的是,研究还表明,“屏蔽链终止”可能是序列上下文相关的,DNA合成可以不受抑制地进行[56].这些数据表明,dFdCMP可以被纳入基因组,并作为下一轮DNA复制的模板。重要的是,模板中的dFdCMP也会阻碍DNA聚合酶在体外合成DNA [7].因此,吉西他滨通过抑制引物的延伸和阻断模板链中的DNA复制两种不同的机制发挥细胞毒作用。如何移除末端引物端附近或模板链中的dFdCMP尚不明确。

XPF-ERCC1复合体是一种结构特异性内切酶,在多种DNA修复途径中发挥多种作用[8- - - - - -10].该复合体负责核苷酸切除修复过程中DNA损伤部位的5 '切口,在ICL修复过程中从DNA链间交联(ICL)释放交联链[11- - - - - -15],是单链退火(SSA)所必需的[16- - - - - -18].XPF-ERCC1复合体还参与活性氧(ROS)诱导的单链断裂(SSB)修复[19].由于吉西他滨诱导的DNA损伤之一可能是在端起引物端附近有dFdCMP的ssb,我们研究了XPF对吉西他滨细胞毒性的影响。xpf缺陷细胞对吉西他滨敏感。一项遗传效应研究表明,XPF与在SSB修复中起主要作用的AP内切酶(APE)在同一通路中起作用。此外,我们还发现吉西他滨治疗后XPF在染色质上的募集依赖于APE。这些结果表明,XPF和APE在吉西他滨诱导的DNA损伤中处于相同的DNA修复途径,XPF可能需要处理APE产生的一个中间DNA结构。

2.材料与方法

2.1.细胞系

CHO UV41、UV135、HeLa S3、BxPC3购自American Type Culture Collection (ATCC)。HCT116和HCT116 shAPE(表达APE1 shRNA以抑制APE的表达)是内布拉斯加州大学医学中心Kishor Bhakat博士的慷慨赠礼。BRCA2缺陷卵巢癌细胞系PE01及其BRCA2逆转物PE01(C4-2)和BRCA2缺陷胰腺癌细胞系CAPAN1及其BRCA2逆转物CAPAN1(C2-1)是日本东海大学谷口俊康博士的慷慨馈赠。

HeLa、BxPC3、PE01、PE01(C4-2)、CAPAN1和CAPAN1(C2-1)在添加10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的DMEM高糖(Hyclone)中培养和维持。HCT116及其衍生细胞系在添加10%胎牛血清的McCoy’s 5A (Hyclone)培养基中培养。所有细胞系在37°C 5%湿润CO2培养箱中培养。

2.2.细胞对DNA损伤剂的敏感性-克隆生存试验

细胞以300~500细胞/孔的速度接种于12孔板中。生长一天后,以指定的浓度加入吉西他滨。细胞在吉西他滨存在下生长5~7天。对于紫外线处理,生长一天后,从每个孔中取出培养基,用1ml PBS清洗细胞两次。去除PBS后,用UVC (254 nm)按指示剂量照射细胞。每孔照射后立即加入新鲜培养基,再孵育5~7天。对于丝裂霉素C (MMC)处理,在生长一天后,添加MMC到指示浓度,细胞孵育2小时。PBS冲洗细胞2次后,每孔加入新鲜培养基,孵育5~7天。奥拉帕尼处理时,按指示浓度加入奥拉帕尼,在奥拉帕尼存在的条件下培养细胞5~7天。菌落用乙醇固定,用结晶紫溶液染色,并计数。 The surviving fractions were calculated by dividing the number of colonies on treated wells by the number on untreated cells. Each surviving fraction with standard deviation from each experiment is listed in Supplementary Table1

2.3.核处理

对XPF和APE的抑制使用siXPF (Dharmacon siGENOME ERCC4 siRNA D-019946-04)和siAPE (Dharmacon ON-TARGET PLUS siRNA HUMAN APEX1 J-010237-07)。细胞在10时播种5在siRNA治疗前一天,在六孔板中每孔有一个细胞。用100 nM siRNA处理细胞5小时。转染使用dharafect1 (Dharmacon)。对于XPF和APE的共抑制,每个siRNA混合100 nM。去除siRNA后,细胞在新鲜培养基中培养48小时。这些sirna处理的细胞用于克隆生存试验。非靶向对照siRNA作为对照。

2.4.利用CRISPR/Cas9生成xpf缺陷突变体

采用CRISPR/Cas9技术生成xpf缺陷HCT116细胞。

XPF的引导序列(5 ' -gccggctcgacggattgcca-3 ')克隆到转移质粒pLentiCRISPR v2(来自GenScript)中。通过使用293FT细胞(Invitrogen公司)的ViralPower Lentiviral表达系统生成慢病毒颗粒。慢病毒感染HCT116和HCT116 shAPE。单菌落在嘌呤霉素存在的情况下建立(2μg/ml),用western blots检测XPF的表达(补充图3 c).由于NER缺陷,xpf灭活克隆表现出紫外线敏感性(补充图3).

2.5.染色质组分的制备

在使用或不使用吉西他滨处理指定的孵育时间后收集细胞,并重新悬置于缓冲液A (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.34 M蔗糖,3 mM CaCl)的2倍细胞颗粒体积(CPV)中22 mM Mg-acetate, 0.1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1 mM DTT和蛋白酶抑制剂)。在4℃摇动孵育30分钟后,在4℃低温3500 x g离心15分钟,收集球粒1 (P1)中的核。上清液(S1:细胞质裂解液)在4℃、20,000 × g高速离心15分钟澄清。洗完P1用500μ将P1重悬于2 × CPV的缓冲液B (20 mM HEPES-KOH pH7.9, 3 mM EDTA, 10%甘油,150 mM醋酸钾,1.5 mM MgCl)中20.1% NP-40, 1 mM DTT,蛋白酶抑制剂)。不溶性染色质粒(P2)的制备方法是:用26号注射器针在冰上划15下均匀化核,然后在4°C下15,000 x g高速离心30分钟。上清液(S2:核裂解液)在4℃、20,000 × g高速离心15分钟澄清。P2被重悬为100μ加入0.2 M HCl,在冰上孵育10分钟。中和pH后加入20μl的1.5 M Tris-HCl (pH 8.8),上清在4℃,2万× g高速离心15分钟澄清,用作染色质组分(S3)(补充图)4).

2.6.西方的屁股

制备全细胞裂解物用于western blot。将收集的细胞重悬到2 × CPV(细胞颗粒体积)的细胞裂解缓冲液(PBS, 1% NP-40, 1% Triton X100, 10%甘油)中,在4℃下孵育15分钟。在4℃16000 g离心10分钟后,上清液作为全细胞裂解液。

细胞裂解物(10-100μg)在sds -凝胶中分离,蛋白质转移到膜上。用5%脱脂干乳在TBST中阻断后,用指示的一抗孵育膜。在x射线片上用ECL (Bio-Rad)获得信号。使用的主要抗体是抗XPF抗体(来自Thermo Scientific的XPF Ab-1克隆219),抗ape抗体(来自Novus bioicals的NB100-116),抗h2ax抗体(来自Bethyl Laboratories的A300-083A),抗tubulin抗体(GT114, GeneTex),抗gapdh抗体(GT239, GeneTex),和抗lamin B (PA5-32474, Thermo Fisher Scientific)。

2.7.统计分析

进行了三次独立实验,结果以平均值和标准差表示。统计显著性由未配对的双尾学生确定t以及。一个P-value<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1.xpf缺陷细胞对吉西他滨敏感

以DNA修复缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系为研究对象,对其DNA修复机制进行了研究。UV41和UV135是对紫外线敏感的突变体,在核苷酸切除修复(NER)中存在缺陷。在NER过程中对DNA损伤产生5 '切口的XPF在UV41中灭活,在UV135中对DNA损伤产生3 '切口的XPG灭活。我们检测了UV41对吉西他滨的细胞敏感性。我们和其他团队此前证实,XPF(作为ERCC1的复合物)去除3 ' -阻塞端,并参与修复DNA氧化损伤和喜树碱诱导的DNA损伤[19- - - - - -21].这个活动是XPF(和ERCC1)独有的,不与其他NER因子共享。“掩模链终止”在引物末端留下一个dFdCMP, DNA聚合酶的外切酶活性无法从引物末端去除dFdCMP。结果,引物的3 '端被dFdCMP阻塞。因此,XPF是去除dfdcmp阻塞的3 '端的一个很好的候选。如图所示1(一)UV41对吉西他滨和野生型人XPF基因在UV41中的表达敏感(补充图1) [12]恢复了对吉西他滨的耐药性(吉西他滨6.4 nM下的存活分数:载体UV41的0.163±0.036,XPF UV41的0.52±0.021)。此外,内/外核酸酶失活XPF (XPF- da)在UV41中的表达[12未能挽救表现型(图1(一);吉西他滨在6.4 nM时存活率:UV41 + XPF组0.52±0.021,UV41 + XPF组0.179±0.041 (DA, p<0.01)。这些数据强烈暗示XPF参与了吉西他滨诱导的DNA损伤的过程。XPF基因在BxPC3(胰腺癌细胞系,图)中的抑制1 (c),在1.6时的存活分数μM吉西他滨:BxPC3为0.089±0.01,xfp抑制的BxPC3为0.041±0.023,p<0.05), HeLa(宫颈癌细胞株,图2,吉西他滨在50 nM下的存活率:HeLa为0.081±0.01,xfp抑制的HeLa为0.018±0.02,p<0.01),结肠癌细胞系HCT116,补充图3 b在125 nM吉西他滨下存活分数:HCT116为0.631±0.022,XPF灭活的HCT116 g4-10为0.109±0.043,<0.01)也使细胞对吉西他滨致敏,证实了XPF在吉西他滨诱导的DNA损伤修复中的作用。

XPF是NER因素之一。因为dFdCMP可以合并到双链DNA中,所以NER可能负责去除这种病变。有趣的是,xpg缺乏的UV135对吉西他滨也表现出中等敏感性(图1 (b)吉西他滨在6.4 nM下的存活率:AA8为0.848±0.038,UV135为0.681±0.025,p<0.05)。结果表明,NER参与了吉西他滨诱导的DNA损伤的修复。

3.2.XPF和APE在修复吉西他滨诱导的DNA损伤中的作用

XPF失活使细胞对ROS敏感,强烈暗示XPF- ercc1在SSB中的作用[19].APE是SSB修复中主要的DNA修复因子之一[22].siRNA在HeLa细胞中对APE的抑制(图2,吉西他滨50 nM下的存活分数:siccontrol组为0.081±0.01,siAPE组为0.032±0.011,p<0.05)证实了先前报道的APE也参与吉西他滨诱导的DNA损伤的修复[23].为了研究XPF和APE之间的遗传关系,在HeLa细胞中通过siRNA抑制XPF和APE,并研究细胞对吉西他滨的敏感性。抑制XPF导致丝裂霉素C (MMC)的敏感性(补充图)2).在HeLa细胞中,XPF和APE的共同抑制导致细胞对吉西他滨的敏感性与抑制单个基因的敏感性相似(图2,补充图2 b).我们还使用错配修复(MMR-)缺陷结肠癌细胞系HCT116获得了类似的结果3 b).HCT116被shRNA本构抑制APE,用CRISPR/Cas9生成XPF突变体(补充图3 c).在被ape抑制的HCT116中,XPF失活不改变细胞对吉西他滨的敏感性。我们得出结论,XPF和APE在吉西他滨诱导的DNA损伤修复中具有遗传上的互性。

3.3.吉西他滨治疗后XPF在染色质上的招募依赖于APE

为了了解吉西他滨诱导的DNA损伤修复机制,我们研究了吉西他滨治疗后XPF在染色质上的募集。吉西他滨治疗诱导了XPF在HCT116染色质上的积累,而吉西他滨没有改变染色质结合的APE的数量(图3.,补充图5).在被ape抑制的HCT116中,XPF的招募明显减少3.).这些数据有力地表明,XPF被招募到经过APE作用后产生的DNA修复中间体中。

3.4.吉西他滨的细胞毒性需要BRCA2

未修复的ssb在下一轮DNA复制后转化为双链断裂(dsb)。因此,同源重组(HR)中的缺陷有望使细胞对吉西他滨敏感。然而,先前的报道表明吉西他滨的细胞毒性确实需要同源重组(HR) [2425].我们检测了brca2缺陷的卵巢癌细胞系PE01及其brca2逆转的PE01(C4-2)对吉西他滨的敏感性。PE01(C4-2)是由brca2突变的PE01长期接触顺铂而获得的PARP抑制交叉耐药克隆之一。PE01(C4-2)中BRCA2恢复,HR完全活跃[26](补充数字6而且6 b).我们的数据表明,与brca2恢复的HR活性PE01(C4-2)相比,brca2缺失的PE01对吉西他滨更耐药(图4)4(一)1 nM吉西他滨存活率:PE01的0.385±0.016,PE01的0.071±0.031 (C4-2), p<0.01; 5 nM吉西他滨存活率:PE01的0.029±0.009,PE01的0.015±0.001 (C4-2), p< 0.05。我们还利用brca2缺陷的胰腺癌细胞系CAPAN1及其brca2逆转的CAPAN1(C2-1)获得了类似的结果(图1)4 (b)在5 nM吉西他滨下,CAPAN1和CAPAN1的存活率分别为0.229±0.011和0.091±0.011 (C2-1), p<0.05;在25 nM吉西他滨下,CAPAN1和CAPAN1的存活率分别为0.051±0.011和0.013±0.009 (C2-1), p<0.05。通过选择长期暴露于顺铂耐药的CAPAN1,将CAPAN1(C2-1)分离为brca2 -回归物之一。经证实,BRCA2基因被逆转,HR活性恢复[27](补充图6摄氏度).这些数据清楚地表明,BRCA2(因此是HR)是吉西他滨诱导的细胞死亡所必需的。

4.讨论

吉西他滨的疗效因人而异。获得性耐药的出现也是吉西他滨治疗的一个关键问题。内源性和获得性吉西他滨耐药是由多种因素引起的,包括吉西他滨代谢基因的表达水平、肿瘤微环境以及吉西他滨诱导的DNA损伤的DNA修复活性状态。因此,了解每个因素/途径的机制,它们如何促进吉西他滨的细胞毒性,以及不同因素/途径如何相互作用以增强或降低吉西他滨的疗效,是制定更有效方案的必要条件。在本报告中,我们发现XPF或APE的失活使细胞对吉西他滨敏感,这两种DNA修复因子在相同的途径中作用,以消除吉西他滨诱导的DNA损伤。有趣的是,吉西他滨诱导的XPF的募集依赖于APE,但在XPF缺失的情况下,染色质上APE的数量并没有改变。这些数据表明XPF- ercc1在APE的下游起作用,XPF可能被招募到APE作用后产生的DNA修复中间体。在使用的条件下,我们没有检测到吉西他滨诱导的APE招募。吉西他滨对APE的招募可能被与染色质结合而没有DNA损伤的APE所掩盖。

吉西他滨可以通过两种不同的方式抑制DNA复制(补充图7).DFdCMP在引物延伸过程中被DNA聚合酶结合。dFdCMP在引物3 '端或附近的存在抑制了引物的延伸反应,形成SSB。引物充分展开时[56],含有dFdCMP的链被用作下一轮DNA复制的模板,模板块DNA链延伸反应中的dFdCMP [7].我们的研究结果表明,引物端dFdCMP可以被XPF-ERCC1和APE一起去除(图1而且2).此外,我们的研究结果显示xpg缺乏的UV135细胞对吉西他滨中度敏感(图1 (b)).核苷类似物也是NER的底物[28].因此,模板中的dFdCMP将被NER删除。值得注意的是,XPG在核苷酸切除修复之外还发挥着额外的作用。XPG相互作用并刺激DNA糖基化酶NTH1,从而作为碱基切除修复的调节因子[29- - - - - -31].NTH1去除各种氧化DNA病变,包括胸腺嘧啶乙二醇。虽然没有NTH1对DNA中dFdC活性的报道,但我们不能排除XPG协同NTH1去除DNA中dFdC的可能性。因此,虽然我们的结果在图1 (b)暗示NER有助于吉西他滨诱导的DNA损伤的修复,需要在其他NER突变体(如XP-A细胞系)上进行额外的实验来确认这种活性。模板中的DFdCMP也可以通过DNA聚合酶eta (PolH)的翻译DNA合成(TLS)绕过[7].这三种途径可能影响吉西他滨的细胞毒性(从而影响其疗效);因此,为了更好地评估吉西他滨对单个患者的潜在疗效,需要识别影响这些途径的基因/因素。

mmr缺乏症对吉西他滨有不良影响。与mmr修复的HCT116相比,mmr缺失的HCT116对吉西他滨的耐药性更强[32].mmr缺失的HCT116中吉西他滨耐药可能是由类似于O6-methylguanine [3334,但具体机制尚不清楚。然而,我们的研究结果表明,XPF(或APE)的失活可以使mmr缺陷的HCT116细胞对吉西他滨敏感。当吉西他滨给药时,XPF-(和APE-)介导的修复途径可能是mmr缺乏症相关患者的潜在靶点。

我们的结果和其他人的报告发现,BRCA2(以及可能参与HR的其他基因)是吉西他滨的细胞毒性所必需的[2425].与brca2修复细胞相比,brca2缺陷细胞对吉西他滨治疗的耐药性更强(图4).这一现象的发生机制尚不清楚;然而,在brca2介导的HR过程中产生的DNA中间结构,如HR过程中的DNA聚合步骤,在dFdCMP和/或dFdCTP的存在下可能是稳定的,而不是正确处理的。在没有HR的情况下,与吉西他滨相关的DSB可能通过DSB修复途径进行修复,该途径不参与长时间的DNA合成,如选择性非同源端连接。因为有一群胰腺癌患者的HR存在缺陷[3536]和吉西他滨是大多数胰腺癌患者的主要药物,在治疗前应仔细评估每个患者的HR活性状态。

我们的研究结果表明,DNA修复活性对吉西他滨的疗效有很大影响。影响XPF-(和APE-)介导的修复途径和调节吉西他滨细胞毒性的另一个DNA修复途径的DNA修复基因的鉴定正在进行中。在个性化医疗时代,我们也应该开发一种评估患者样本中这些DNA修复活性的方法,以正确评估吉西他滨的潜在疗效。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在文章及其补充信息中找到。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

我们感谢Toshiyasu Taniguchi博士(日本东海大学)的卵巢癌细胞株PE01和PE01(C4-2)和胰腺癌细胞株CAPAN1和CAPAN1(C2-1),以及Kishor K. Bhakat博士(内拉斯加州大学医学中心遗传学、细胞生物学和解剖学系)的结肠癌细胞株HCT116和HCT116 shAPE。我们还要感谢两位埃普利学院暑期本科生研究项目的学生,Jacquelyn Peck (Creighton University, Omaha, NE)和Anthony Cloyd (Hasting Collage, Hasting, NE),感谢他们在一些实验中的技术贡献。这项工作得到了美国国家癌症研究所弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心资助基金的部分支持。e CA036727。

补充材料

补充图1:CHO UV41细胞中野生型人XPF和内切酶缺陷型人XPF(DA)的表达。补充图2:证实了xpf抑制细胞的DNA修复缺陷表型。补充图3:xpf缺陷HCT116细胞的基本特征。补充图4:细胞裂解物的生化分离。补充图5:吉西他滨对APE招募到染色质的影响。补充图6:brca2缺陷细胞及其hr恢复细胞的特征。补充图7:建议的去除吉西他滨诱导的DNA病变的机制。补充表1:各实验存活分数的标准差表。补充材料

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