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体积 2021 |文章的ID 8815202 | https://doi.org/10.1155/2021/8815202

Hélène Moche, Aouatif Chentouf, Sergio Neves, Jean-Marc Corpart, Fabrice neslany 的比较在体外邻苯二甲酸盐及替代增塑剂的内分泌活性”,毒理学杂志》 卷。2021 文章的ID8815202 14 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/8815202

的比较在体外邻苯二甲酸盐及替代增塑剂的内分泌活性

学术编辑器:You-Cheng Hseu
收到了 2020年7月27日
接受 2021年1月16日
发表 09年2月2021年

摘要

由于邻苯二甲酸盐的有害影响,已经采取法规来减少它们的使用,对替代品的需求正在增加。由于担心邻苯二甲酸盐的内分泌干扰特性,有必威2490必要特别研究这些影响,以寻找潜在的替代品。在本研究中,我们比较了在体外几种已经使用的潜在增塑剂替代品(DEHT, DINCH和TOTM)或新的替代品(polyorb®iso山核桃酯和polyorb®ID 46)对2种邻苯二甲酸酯之一,DEHP和DINP的内分泌活性。这些化学物质对内分泌干扰的3种常见机制,即与雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)的相互作用或甾体生成的影响已被广泛研究在体外方法。在E-Screen实验中,只有DEHP中度诱导MCF-7细胞增殖;其他被测试的物质都不是雌激素或抗雌激素的。MDA-kb2细胞中未显示任何邻苯二甲酸盐或替代品的雄激素或抗雄激素活性。另一方面,DEHP和DINP,以及DEHT、DINCH和TOTM,在H295R实验中,主要通过诱导雌二醇合成增加而破坏甾体生成;未观察到聚orb®异山梨酯和聚orb®ID 46的这种影响。

1.简介

邻苯二甲酸酯或邻苯二甲酸酯是一类合成有机化学品,主要用于聚合物工业的增塑剂。它们主要用于制造聚氯乙烯(PVC),使其灵活,易于加工。因此,邻苯二甲酸盐被用于生产各种各样的物品,如建筑产品、汽车产品、服装、运动器材、行李、玩具和医疗器械[1- - - - - -4].

邻苯二甲酸盐不与PVC聚合物发生化学结合,因此,在接触液体或脂肪或温度或pH变化时,它们可以从产品中迁移。因此,它们可以被释放到周围的环境中[3.5],人类可通过口服、吸入和皮肤或肠外途径接触[67].一些邻苯二甲酸酯被描述为具有内分泌干扰特性:事实上,许多研究表明,在雄鼠子宫内或围产期暴露后,一些邻苯二甲酸酯具有抗雄激素活性,并诱导雄性生殖道发育的改变[8- - - - - -10].评论(4]得出的结论是,在人群中观察到的邻苯二甲酸酯暴露水平可能会对男性生殖产生影响,特别是对邻苯二甲酸二酯(2-乙基己基)(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。

由于对邻苯二甲酸盐的有害影响日益关注,已采取法规来减少邻苯二甲酸盐的使用。四种邻苯二甲酸盐现已被纳入欧洲化学品注册、评估、授权和限制条例(REACH)附件XIV,列出了高度关注的物质,在使用前需要授权,并被归类为繁殖毒性物质(1B类):邻苯二甲酸苄丁酯(BBP)、DEHP、DBP和邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)。在欧洲,一些邻苯二甲酸盐在REACH法规(附件XVII)中被限制用于玩具和儿童用品:DEHP、DBP和BBP。继最近公布对附件XVII的修订后[11,同样的限制将在2020年7月后适用于DIBP,这4种邻苯二甲酸盐将在更广泛的产品的塑化材料中受到限制(不仅仅是玩具和儿童用品)。因此,在RoHS (Restriction of Hazardous Substances)指令中,DEHP、DBP、BBP和DIBP被限制用于电缆和电线的绝缘。指令2007/19/EC对邻苯二甲酸盐在与食品接触的材料中使用的一些限制规定:禁止DIBP,食品中DEHP、DBP、BBP以及(连同其他物质)DIDP和DINP的特定迁移限制。此外,邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)和邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)被限制用于儿童可放入口腔的玩具和儿童用品(REACH附件XVII)。有关几种邻苯二甲酸盐的类似限制在美国也适用[12].此外,化妆品中亦禁止使用一些邻苯二甲酸盐(例如DBP、BBP和DEHP) [13].

由于各种邻苯二甲酸盐的毒性作用和使用限制,有必要进行替代。许多具有不同化学结构的可替代增塑剂要么已经使用,要么正在开发中。其中,1,2-环己二羧酸二异壬基酯(DINCH)、三-2-乙基己基三甲酸酯(TOTM)和双-2-乙基己基对苯二甲酸酯(DEHT)已经作为邻苯二甲酸酯的替代品广泛应用[14].对苯二甲酸酯与邻苯二甲酸酯非常相似,两个环取代占据对位而不是邻位。DEHT是DEHP的一种结构异构体,是最常见的对苯二甲酸酯,被广泛用作商业替代品,如塑料玩具和儿童用品、薄膜、路面、剥离化合物、乙烯基产品和饮料瓶盖[14].三聚物tom用于高温应用,如PVC电缆,与其他DEHP替代品相比,其萃取和迁移阻力显著提高[14].DINCH在医疗设备、玩具和食品包装材料中被用作替代增塑剂,取代邻苯二甲酸盐,如DEHP和DINP。

作为邻苯二甲酸盐的植物替代品,ROQUETTE公司开发了一种100%生物来源的增塑剂,polyorb®ID 46。polyorb®ID 46是异山梨酯与植物脂肪酸酯化得到的二酯的混合物。polyorb®ID 46由以下成分组成:(3R,3aR,6S,6aR)-六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3,6-二基二辛酸酯,(3S,3aR,6R,6aR)-6-(辛酸氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-癸酸酯,(3R,3aR,6S,6aR)-6-(辛酸氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-癸酸酯,和(3R,3aR,6S,6aR)-六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3,6-二基双(癸酸酯)。这种异山梨酯衍生物尤其可用于塑化PVC。POLYSORB®异山梨酯是一种高纯度级单体,专门设计用于制造许多聚合物和非聚合物衍生物,如polyorb®ID 46。无论是直接作为纯单体使用,还是以衍生物(功能化单体或增塑剂)的形式使用,POLYSORB®异山梨酯为性能材料市场提供有价值的解决方案:聚酯,聚碳酸酯,PVC,复合材料和涂料,聚氨酯,TPU等。POLYSORB®ID 46提供标准通用一级增塑剂的性能,与PVC树脂具有出色的兼容性和可加工性。由于其巨大的效率,它可以被认为是标准的石化基增塑剂的替代选择。根据主要塑料生产地区的化学控制法律注册的POLYSORB®ID 46,已经是许多毒理学研究的对象(在该研究中没有观察到影响在体外而且在活的有机体内基因毒性研究、发育毒性研究和口服90 d重复剂量毒性研究[15]),建议用于与最终用户直接接触的场合(医院地板、室内装饰表面、学校家具等)。

考虑到邻苯二甲酸酯的内分泌干扰特性,有必必威2490要研究聚orb®ID 46和其他潜在的邻苯二甲酸酯替代品的这些影响。在本研究中,我们的目的是比较在体外几种已经使用的潜在替代增塑剂(DEHT, DINCH和TOTM)或新的替代物polyorb®ID 46对2邻苯二甲酸盐,DEHP和DINP中的一种的内分泌活性在体外化验。我们还在研究中加入了用于生产polyorb®ID 46的单体polyorb®异山梨酯。这些化学物质对内分泌干扰的3种常见机制,即与雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)的相互作用或甾体生成的影响已被广泛研究在体外方法:MCF-7增殖试验(E-Screen试验)[16],使用MDA-kb2细胞系进行AR反激活实验[17],以及H295R类固醇生成测定(经济合作及发展组织(经合发组织)测试指引第456号[18].MDA-kb2试验类似于稳定转染的人类雄激素受体转录激活试验,用于使用AR-EcoScreen™细胞系检测雄激素激动剂和拮抗剂活性,OECD试验指南第458号[19].所有这些化验均纳入经合发组织《测试及评估内分泌干扰化学品概念框架》的第2级[20.]对应于"在体外分析提供了所选内分泌机制/通路的数据。”必威2490

2.材料和方法

2.1.化学物质

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)来自默克公司,邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、对苯二甲酸二异壬酯(DEHT)和三(2-乙基己基)三聚体(TOTM)来自Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France), 1,2环己二甲酸二异壬酯(DINCH)来自巴斯夫公司。所有这些化合物的纯度都至少为96%。polyorb®异山梨酯(纯度>99.5%)和polyorb®ID 46(纯度>96%(批号YE008)或94.5%(批号YE34))由ROQUETTE公司合成。杜尔贝科改良鹰培养基(DMEM)含和不含酚红、胎牛血清(FBS)、莱博维茨L-15培养基含和不含酚红、杜尔贝科改良鹰培养基和火腿F-12营养培养基(DMEM/F12)不含酚红、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和碳-葡聚糖剥离的FBS (CD/FBS) 1:1混合,用于E-Screen检测,来自Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)。17β用于MDA-kb2测定的-雌二醇、ICI 182780(富威司特)、双氢睾酮(DHT)、羟氟他胺、福斯柯林、咪氯az和CD/FBS来自Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France)。

邻苯二甲酸酯及其替代品在DMSO或乙醇中溶解。在细胞培养基中稀释实验时,溶剂浓度不超过0.1%。

2.2.E-Screen化验

MCF-7细胞增殖试验(E-Screen试验)按照Soto等人的方法进行[16经过修改[21].

2.2.1.细胞培养

雌激素应答MCF-7细胞(BUS原液)取自Pr. Ana Soto(美国波士顿塔夫斯大学)。MCF-7细胞在添加5%胎牛血清的DMEM培养基中,37°C, 5% CO条件下生长和保存2和95%的湿度。

2.2.2.E-Screen化验

实验在24孔板(Falcon, Corning)中进行,将细胞以15000个细胞/孔的密度接种在培养基中,并允许粘附24小时。在附着期结束时,在给药前用显微镜检查被镀的细胞,以确保它们处于良好的状态(附着,形态)。用PBS清洗细胞,将细胞暴露于实验培养基(DMEM,不含酚红,加5% CD/FBS)的加药液中,在37°C, 5% CO孵育120小时2和95%的湿度。对于每种化合物,进行了两种独立的激动剂和拮抗剂试验,如下所述,在2中可能调整浓度范围nd化验。

(1)受体激动剂化验.每个测试板包含7个浓度的邻苯二甲酸盐或替代品和溶剂对照(SC: DMSO或0.1%的乙醇)。每次试验还包括一个阳性对照板,其中细胞暴露于5个浓度的参考雌激素17β雌二醇(10−9-10年−10-10年−11-10年−12-10年−13M)三复井。

(2)拮抗剂化验.加药溶液配制在实验介质中,辅以固定浓度的E2 (1 pM)。每个测试板包括5个浓度的邻苯二甲酸盐或替代物,溶剂对照(SC: DMSO或0.1%的乙醇)和ICI 182780 (1 nM)作为抗雌激素参比化合物,每个3个重复。每个测试板包括3个重复孔,在不含E2的实验介质中稀释溶剂。

(3)竞争性确认激动剂试验.为了研究ER在DEHP诱导的MCF-7细胞增殖中的作用,我们检测了纯抗雌激素ICI 182780对DEHP诱导的细胞增殖的影响[21].在DEHP存在的培养基中加入ICI 182780(最终浓度为1 nM),使其诱导细胞增殖的浓度最高。添加E2 (10 pM)作为阳性对照。

(4)竞争性确证拮抗试验.为了研究ER在DINP-和DEHT-诱导的E2诱导的MCF-7细胞增殖下降中的作用,我们研究了E2浓度增加对DINP和DEHT抑制细胞增殖的影响。将细胞暴露于10、100和1000 pM E2的实验培养基中,并添加固定浓度的DINP (30μM)或DEHT (300μM),这些浓度对e2诱导的细胞增殖的抑制作用最大。作为比较手段,溶剂,纯抗雌激素ICI 182,780 (1 nM)和CCCP(羰基氰化物3-氯苯基腙,2.5μM)作为细胞毒性参考。

2.2.3.细胞增殖评价

对于所有类型的测定,在5天暴露期后,通过使用SRB (sulforhodamine B)测定总蛋白含量来测定每个孔的细胞密度。丢弃给药培养基,细胞在4℃下用10% (w/v)三氯乙酸(Sigma-Aldrich)冷固定30 min。然后用脱盐水冲洗井4次,风干。用0.4% (w/v)的SRB (Sigma-Aldrich)溶液在1% (v/v)乙酸中染色10分钟。用1%的醋酸洗井,去除未结合的SRB,然后风干。结合的SRB染料溶于Tris碱溶液(10 mM, pH 10.5),在摇板上摇板,直到染料完全溶解。光密度(OD)使用SPECTROstar®纳米设备(BMG Labtech, Champigny s/Marne,法国)在530 nm, 690 nm参考波长下测定。考虑到实验培养基中含有蛋白质,在无细胞实验培养基中孵育的3孔背景孔的OD530-690值减去每孔OD530-690值的平均值。

计算各化合物浓度下的增殖效应,对应于各化合物浓度下的OD530-690值与溶剂控制下的OD530-690值之比。每个邻苯二甲酸盐或替代浓度的数据用三孔的平均值±标准差(SD)表示。

2.2.4.统计分析

在激动剂和拮抗剂试验中,使用Dunnett 's试验进行统计分析,比较各浓度试验项目诱导的细胞增殖与溶剂对照(激动剂试验)和溶剂对照(E2试验)中观察到的细胞增殖。在确证激动剂试验中,使用曼-惠特尼试验比较了ICI 182780和不使用ICI 182780所观察到的增殖效应的差异。采用统计软件GraphPad InStat version 3.10进行分析。差异被认为在

2.3.MDA-kb2雄激素受体反式激活试验

Wilson等人最初描述的使用MDA-kb2细胞的AR反激活实验[17]基本上按照Ermler等人修改的方案进行[22].OECD TG No 458所描述的方法[19]用于结果分析和解释。

2.3.1.细胞培养

MDA-kb2细胞系(ATCC CRL-2713)取自美国类型培养库(ATCC, Manassas, VA, USA)。MDA-kb2细胞在Leibovitz的L-15培养基中生长并维持,该培养基中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素37°C,不加CO2

2.3.2.MDA-kb2化验

在电镀前,细胞在不含酚红的莱博维茨L-15培养基中驯化24小时,该培养基中添加10%木炭-右旋糖精处理的胎牛血清和青霉素/链霉素。然后将细胞以5 × 10的密度镀在96孔白色发光板上4在50个细胞/好μL实验培养基,使其附着24小时。细胞同样被镀在标准96孔板中,用于MTT细胞毒性试验。在附着期结束时,2倍浓度的加药溶液直接加入白色板和标准板的孔中,一式三份。盘子在摇板机上短暂搅拌,然后返回培养箱20至24小时。对于每种化合物,进行了两种独立的激动剂和拮抗剂试验,如下所述,在2中可能调整浓度范围nd化验。

(1)受体激动剂化验.加药溶液在实验介质中制备,包含溶剂、测试化合物或参考雄激素二氢睾酮,其浓度为预期最终浓度的两倍。每种邻苯二甲酸盐或替代品分别制备7个稀释度,以及7个稀释度的DHT(最终浓度为10−12到10−6米)。

(2)拮抗剂化验.加药溶液配制在实验介质中,添加了0.5 nM DHT(两倍于预期的最终浓度0.25 nM),并包含溶剂,测试化合物,或两倍于预期最终浓度的参考抗雄激素羟氟他胺。每种邻苯二甲酸盐或替代物配制6个稀释度,以及6个稀释度的羟基氟他胺(最终浓度为10−10到10−5米)。另外,在3孔中加入不含DHT的溶剂对照。

(3)竞争性确证拮抗试验.如果认为有必要区分实际的拮抗作用和非特异性作用(如细胞毒性相关作用),则进行竞争性的确证拮抗试验,试验项目的浓度在标准拮抗试验中诱导最大效果,并增加DHT的浓度。给药溶液配制在实验培养基中,以预期浓度的两倍添加测试项目,并包含参考雄激素DHT的浓度不断增加(最终浓度0-0.1-0.25-0.5-1-5和10 nM)。此外,还在添加了溶剂或羟基氟他胺(最终浓度为1μM)或CCCP(3-氯苯腙羰基氰化物,最终浓度10μM)作为抗雄激素和细胞毒性参考化合物。

2.3.3.细胞活力评估

在20至24小时暴露期结束时,在专用板上使用比色法MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯四唑溴化铵)测定[23].取空所有孔,每孔加入不含酚红的MTT溶液(0.5 mg/mL)。培养皿在37°C孵育2-2.5小时。然后去除含有MTT的培养基,向孔中加入异丙醇/HCl 1n的混合物。将模板放置在振动板上搅拌,直到formazan晶体完全溶解。用分光光度仪测定570 nm波长下640 nm参考波长下的光密度。

细胞活力的表达相对于平均反应在溶剂控制孔,只有浓度诱导至少80%的活力被分析。

2.3.4.荧光素酶活性测定

暴露20-24小时后,在96孔板上测量荧光素酶活性。清空平板,在孔中加入不含酚红的DMEM和Steady-Glo®荧光素酶测定系统试剂(Promega, Madison, USA)。在轨道板振动器上以500转/分的速度搅拌平板10分钟,使用发光仪(Tecan Infinite®Lumi, Tecan,瑞士)测量发光。发光信号根据背景(无细胞孔)进行校正,并以相对光单位(RLU)表达。

2.3.5.分析的结果

结果的分析和解释采用OECD TG 458 [19].相对转录活性(RTA)被计算为每个浓度的邻苯二甲酸盐和替代品。在激动剂试验中,RTA相对于DHT 10 nM,设置为100%,按以下公式计算:

在拮抗实验中,RTA相对于DHT的溶剂控制,设置为100%,计算公式如下:

对于每个浓度,三孔的RTA均以平均值±SD表示。如果合适,诱导RTA的浓度分别为10%和50%的DHT 10 nM效应(PC10和电脑50)和诱导30%和50%转录活性抑制浓度的溶剂对照DHT (IC30.和集成电路50)在拮抗试验中被测定。一种物质在激动剂试验中被认为是阳性的,如果PC10至少可在2或3次试验中的2次计算;一种物质在拮抗试验中被认为是阳性的,如果IC30.至少可在2或3次化验中的2次计算。

在竞争性确认拮抗剂试验中,相对于溶剂对照(设置为1)的荧光素酶活性是通过每孔测量的RLU除以SC孔测量的平均RLU来计算的。

2.4.H295R类固醇生成分析

H295R甾体生成实验根据OECD TG No. 456 [18和Hecker等人[2425].进行了两种独立的测定,在2nd化验。

2.4.1.细胞培养

H295R人腺癌细胞系(NCI-H295R, ATCC CRL-2128)购自ATCC (Manassas, VA, USA)。细胞在不含酚红的Dulbecco改良鹰培养基和火腿F-12营养物质(DMEM/F12)的1:1混合培养基中培养,添加2.5%的nua - serum™(康宁)和1%的ITS +预混剂(胰岛素、转铁蛋白、硒酸、牛血清白蛋白和亚油酸,康宁),温度为37℃,5% CO2和95%的湿度。H295R细胞解冻后培养5 ~ 10代后开始实验。

2.4.2.曝光

实验在24孔板上进行,细胞最初以250000个/孔的密度接种,并允许粘附24小时。测试板包括3个重复的7种化学浓度和溶剂控制(SC: DMSO或0.1%的乙醇)。质量控制(CQ)板包括2个浓度的类固醇生成诱导剂福斯考林(1和10μM), 2个浓度的抑制剂咪鲜az(0.1和1μM)、空白(仅为培养基)n和SC (DMSO 0.1%)组成3个重复,以及6孔细胞毒性参考孔,在暴露结束时加入70%的乙醇。测试板和QC板在37°C和5% CO孵育248 h。在48 h暴露期结束时,收集每孔中的培养基,离心清除颗粒,然后进行激素测定(3000 rpm, 10分钟)。为了防止细胞干燥,在细胞活力评估前,每孔加PBS。

2.4.3.细胞生存能力评估

如前所述,使用MTT法分析每个孔的细胞活力。细胞存活率是相对于SC孔的平均反应来表达的,SC孔被认为是100%活细胞,并使用以下公式来计算,乙醇井被认为是100%死细胞:

相对于溶剂对照的平均活性,活性低于80%的井不包括在最终的数据分析中。对于相对于溶剂对照中平均生存力在80% - 85%之间的井,根据相应的生存力校正激素浓度,以避免对潜在激素调节的任何误解。

2.4.4.激素测量

根据制造商的说明书,使用适当的ELISA试剂盒(睾酮和雌二醇参数™ELISA试剂盒,R&D系统)对离心上清进行睾酮(T)和雌二醇(E2)测量,为优化需要做一些修改:T和E2标准品和用于T分析的样品在不含血清的细胞培养液中稀释,而不是试剂盒中提供的稀释剂。在试验开始之前,进行干扰试验,以检测试验项目对激素测量系统的潜在干扰。

为了评估每个邻苯二甲酸盐或替代品浓度的激素生产的相对变化,结果表示为相对于每个测试板中平均溶剂控制的fold changes。对于每种激素,每个孔的折叠变化计算如下:

每一个邻苯二甲酸盐或替代物浓度的数据都用三孔重复变化的平均值±标准差(SD)表示。

2.4.5.统计分析和结果解释

结果分析采用OECD TG 456 [18].在进行统计分析之前,使用Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性假设。当数据为正态分布时,使用Dunnett检验分析化学浓度组和溶剂对照组之间的差异。当数据不是正态分布时,使用曼-惠特尼检验分析化学浓度组和溶剂对照之间的差异。采用统计软件GraphPad InStat version 3.10 (GraphPad software, San Diego California, USA)进行分析。差异被认为在

如果在至少2次独立测定中,E2和/或T浓度的fold change在2个相邻浓度下与溶剂控制在统计上不同,则该物质被认为是阳性的[18].

3.结果

3.1.E-Screen检测中邻苯二甲酸盐和替代品的雌激素活性

在激动剂E-Screen试验中,与溶剂对照相比,DEHP是唯一能诱导MCF-7细胞增殖显著增加的化合物(图1(一)).然而,这种统计学上显著的增加是适度的,在DEHP浓度为3.10时,增殖效应最大为5.25−5M,相当于雌二醇诱导增殖作用的30%左右。必威2490DEHT也能显著增加细胞增殖(图1)1 (b)),但增殖作用很弱(低于溶剂对照增殖作用的2倍,低于E2诱导增殖作用的10%),且在浓度为10时观察到这种效应−4M,被认为无关紧要。其他任何替代品,或DINP,都不能诱导MCF-7细胞增殖的显著增加,浓度为10−9M到10−4到10−3M(图1).

3.2.E-Screen检测中邻苯二甲酸盐和替代品的抗雌激素活性

DEHP、DINCH、TOTM、polyorb®iso山梨酯或polyorb®ID 46在浓度为10时,未观察到f2诱导的MCF-7细胞增殖显著下降−8到10−7M到10−5到10−4M。只有DINP和DEHT能显著降低e2诱导的MCF-7细胞增殖(图1)3.).然而,对于这两种化合物,这只在最高浓度,即DINP 3.10时观察到−5M和DEHT 3.10−4M,并在竞争分析中存在浓度不断增加的E2(图4)时,该效应被认为是非特异性的。事实上,在每个E2浓度下,溶剂与DINP或DEHT之间的增殖抑制并没有随着E2浓度的增加而降低,ICI 182780的情况也是如此。此外,还发现了dinp30的抑制作用μM值很低。

3.3.MDA-kb2细胞中邻苯二甲酸盐和替代品AR基因报告检测的雄激素活性

只有在MTT试验中,与对照组相比,诱导80%以上活性的浓度才能分析AR活性。所有被测试的化合物都没有引起任何反应在体外MDA-kb2实验中AR激动剂活性的浓度范围为10−9米到10−4或10−3M(图5).

dht诱导的荧光素酶活性只有在邻苯二甲酸酯DEHP和DINP分析浓度最高时才能观察到,即10−4米和10−3分别为M(数字6(一)和6(b))。增加DHT浓度不会逆转这些下降(图6(c)),因此不认为是由特定的抗雄激素机制介导的。5种被研究的替代物在浓度为10时均未诱导dht诱导的荧光素酶活性下降−8米到10−4或10−3M(图7).

3.4.在H295R类固醇生成实验中邻苯二甲酸酯和替代品对雌二醇和睾酮产生的影响

分析中只包括非细胞毒性浓度;与对照组相比,MTT试验中诱导存活率低于80%的浓度未分析激素的产生。与溶剂控制相比,在2个相邻浓度下,即1和3,DEHP诱导H295R细胞中E2产量显著增加μM,在3时观察到最大的效应(2倍)μM(图8).在相同浓度下,也观察到较弱(最多1.3倍)但统计上显著的T产量增加(图9).在相邻的7个浓度下,DINP也能诱导E2产生显著增加,从0.03增加到30μM,在30岁时观察到最大的效应(4.7倍)μM(图8).从1到30,T的产生微弱(1.3倍),但统计上显著增加μM没有任何浓度-效应关系(图9).

在相邻的4个浓度下,DEHT诱导E2产量从10增加到300μM,当浓度为300时,效果最大(2.6倍)μM(图8).在30的中间浓度下,观察到T产生微弱(1.2倍)和散发效应μM被认为不显著(图9).在4个相邻浓度下,DINCH诱导E2产量从0.1增加到3,具有统计学意义μM,在3μM(图8).在1和3位点也观察到较弱但统计上显著的T产量增加μM(图9),在3μ在相邻的4个浓度下,M. TOTM诱导E2的产生显著增加,从0.3到10μM,在10时观察到最大的效应(2倍)μM(图8).仅在单一浓度下(10μM)不被认为是显著的(图9).

在浓度高达1000时,polyorb®isosorbide和polyorb®ID 46没有诱导E2或T产物的任何显著变化μ米和100μ分别为M(数字8而且9).

4.讨论

由于几种邻苯二甲酸盐的使用受到限制,替代品的生产和使用日益增加。在本研究中,我们的目的是比较2邻苯二甲酸盐,DEHP和DINP与邻苯二甲酸盐的替代品,在在体外允许检测(抗)雌激素,(抗)雄激素,或甾体生成干扰化合物的分析。描述良好的E-Screen试验用于检测(抗)雌激素活性[1621].为了研究(抗)雄激素活性,使用MDA-kb2细胞进行AR反激活实验[17],类似于OECD TG 458中描述的测定[19),执行。使用OECD TG 456中描述的H295R类固醇生成实验研究了对类固醇生成的影响[18].

作为邻苯二甲酸酯的替代品,我们研究了DEHT、tom、DINCH、polyorb®iso山梨酯和polyorb®ID 46。

在全球范围内,我们对邻苯二甲酸酯DEHP和DINP的研究结果表明,它们都增加了H295R细胞中雌二醇的产生;虽然统计上显著,睾酮生产的微弱增加被认为是低相关性。在E-Screen试验中,只有DEHP是中度雌激素,而在MDA-kb2试验中,这两种邻苯二甲酸盐都不是雄激素或抗雄激素。我们关于类固醇发生的DEHP结果仅部分符合Mankidy等人的结果[26研究表明,在H295R细胞中,不仅E2分泌增加,而且睾酮分泌减少。另一项研究在H295R细胞和人类睾丸外植体中也观察到睾酮分泌减少[27];相反,Hadrup等人[28研究表明,H295R细胞的睾酮分泌没有任何变化。根据DEHP的一种假定的作用模式,在类固醇发生试验中预期睾酮产生会显著减少,而我们的结果并非如此。应该指出的是在活的有机体内, DEHP水解生成多种代谢物。其中,MEHP和2-乙基己醛已被证明能影响MA-10小鼠Leydig肿瘤细胞的甾体生成[29].人体缺乏新陈代谢系统在体外内分泌干扰的分析经常被指出,可以认为这可以解释我们的结果。然而,Desdoits-Lethimonier等人[27]表明在人睾丸外植体和H295R细胞中,DEHP被加工成MEHP,而后者被进一步加工成5OH-MEHP。

关于我们在E-Screen实验中的结果,Okubo等人也观察到了DEHP对MCF-7细胞的增殖作用[30.和Tanay Das等人[31],后一项研究也报道了ER的增殖α-阴性MDA-MB-231细胞,质疑应答的er依赖性。我们的结果恰恰相反,因为DEHP诱导的MCF-7细胞增殖在抗雌激素ICI 182780存在时受到抑制。在文献中,DEHP的ER基因报告基因检测结果也是异质性的:在MVLN反式激活报告基因检测中,DEHP没有诱导任何雌激素反应[2632]或呃α激活在她α-HeLa9903细胞(33),呃α-HEK细胞(34或CV-1细胞[35];重组人ER中DEHP为阴性α分析(33].相反,用激动剂急诊室α在CHO-K1细胞的反式激活实验中显示活性[36].ER未显示拮抗剂活性αtransactivation化验(3436但DEHP展出了ERβ-介导的抗雌激素活性[36].

同样,我们在MDA-kb2试验中的结果与其他研究中的一些结果相对应。Engel等人研究MDA-kb2细胞[34]对DEHP没有表现出任何激动剂活性,但它是一种拮抗剂。沈等[35]报道了高浓度DEHP (10−4M)在MDA-kb2细胞中。在类似的在体外DEHP既非雄激素也非抗雄激素[36- - - - - -39].

关于另一种邻苯二甲酸DINP的文献资料较少。没有发现关于在体外类固醇生成,但在活的有机体内, Borch等[9研究表明睾丸中的睾酮分泌减少。据我们所知,DINCH之前还没有在E-Screen检测中被研究过,但其他方法的结果在体外雌激素测定结果与E-Screen测定结果在全球范围内一致。事实上,在急诊室α反转录激活试验表明,DINP不作为激动剂[323436];呃α一些研究显示拮抗剂的活性[34但在其他地方不[3236].在在体外在MDA-kb2细胞或其他细胞中进行AR反激活实验,未观察到DINP具有显著的激动剂或拮抗剂活性[343637].这证实了我们在MDA-kb2细胞中的结果。

关于邻苯二甲酸酯的替代品DINCH, Engel等[40]在H295R甾体生成实验中报道,浓度为10时雌二醇合成轻微,但统计上不显著μ米和100μM和睾酮合成的浓度为100μM.在我们的结果中,然而,DINCH诱导H295R细胞中雌二醇分泌显著增加。在另一个在体外DINCH对胎间Leydig细胞睾酮产生具有双期影响在体外在10岁时,睾丸激素分泌增加−6M,并在高浓度为10时降低−4米(41].与我们在MDA-kb2细胞中进行的E-Screen实验和AR反激活实验的结果相似,DINCH没有诱导或抑制ERα,呃β或AR活性基因报告基因分析α-HEK,呃β-HEK和MDA-kb2细胞[40].

至于其他2种可替代增塑剂DEHT和TOTM,它们在MDA-kb2细胞的E-Screen检测中均未显示任何雌激素或抗雌激素活性,在AR基因报告基因检测中均未显示任何雄激素或抗雄激素活性。然而,在H295R类固醇生成实验中,它们都诱导了细胞雌二醇产生的明显增加。

总的来说,当可以进行比较时,我们在一系列测试中获得的结果与公布的数据相似。

我们还在这项研究中加入了邻苯二甲酸酯的新替代品,polyorb®ID 46,以及用于其生产的单体,polyorb®异山梨酯。与其他被测试的替代品类似,它们在MDA-kb2细胞的E-Screen检测中都不是雌激素或抗雌激素的,在AR基因报告基因检测中也不是雄激素或抗雄激素的。有趣的是,与所有其他被测试的化合物(邻苯二甲酸盐和其他替代品)相反,polyorb®异山梨酯和polyorb®ID 46在H295R类固醇生成分析中没有诱导任何显著影响。

5.结论

除了DEHP在E-Screen实验中表现出适度的雌激素活性外,在我们的结果中,在E-Screen实验中测试的物质都不是雌激素或抗雌激素的,在MDA-kb2细胞的AR反激活实验中测试的物质也不是雄激素或抗雄激素的。总体而言,DEHP和DINP邻苯二甲酸盐以及DEHT、DINCH和TOTM在H295R实验中破坏了类固醇生成,主要是通过诱导雌二醇合成增加。相反,没有观察到聚orb®异山梨酯和聚orb®ID 46的这种影响。因此,它们是邻苯二甲酸盐的替代物。当可以进行比较时,我们的结果与可用的发布数据在全球范围内相似,这意味着这组测试是相当可靠的在体外数据相关。的电池在体外进行化验是为了确定是否有任何警报。我们认为,在触发警报的情况下,一个在活的有机体内在得出结论之前需要确认。

数据可用性

支持本研究结果的原始数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明这篇文章的发表不存在任何利益冲突。

致谢

这项工作由ROQUETTE公司资助。

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