乳腺癌荧光引导手术中her2靶向抗体的比较

摘要

背景．尽管治疗的进步提高了人表皮生长因子受体2 (HER2)阳性乳腺癌患者的生存率，但残留疾病的检测仍然具有挑战性。在这里，我们研究了两种被批准的抗her2单克隆抗体(mAbs)，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，作为开发荧光引导手术免疫偶联物(FGS)的潜在候选药物。方法．单克隆抗体被偶联到近红外荧光(NIRF)染料IRDye800上，用于定量在体外评估，以放射性金属螯合剂，去铁胺，使双标记与⁸⁹Zr型。在体外在her2过表达(BT474, SKBR3)和her2阴性(MCF7)细胞系中评估结合。采用BT474和MCF7异种移植在活的有机体内而且体外荧光成像。结果．在体外结果显示，her2介导的两种荧光免疫偶联物结合与使用双标记免疫偶联物的放射配基测定一致。在活的有机体内而且体外研究表明荧光标记的单克隆抗体在肿瘤中优先积累，肿瘤与背景的比例相似。在活的有机体内切除肿瘤和正常组织的免疫组化染色证实了HER2特异性。结论．我们首次展示了荧光曲妥珠单抗和帕妥珠单抗免疫偶联物具有类似的NIRF成像性能，并证明了使用具有独特表位特异性的药物进行her2靶向FGS的可能性。

1.简介

乳腺癌是美国妇女中最常见的癌症和第二大癌症死亡原因，2019年估计发病率为26.86万例新病例，估计死亡人数超过41,760人[1］．乳腺癌治疗的核心部分是完全的手术切除肿瘤，以及辅助治疗，包括放射治疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗。当手术切除不完全且手术切缘呈阳性时，同侧乳腺肿瘤复发的风险增加一倍以上[2］．由于侵袭性疾病和导管原位癌(DCIS)病变通常难以察觉，外科医生通常不仅依靠术前成像来定位肿瘤，还需要在手术室中借助三维空间定位来确定切除的组织和数量。术中肿瘤可视化的困难可能导致切缘阳性的切除不充分，或者相反，过度切除组织可能导致毁容。

荧光引导手术(FGS)是一种新兴的成像技术，通过增强外科医生实时从非癌组织中区分癌症的能力，实现术中肉眼看不到的肿瘤检测，有可能改善手术、肿瘤和肿瘤整形的预后。近红外荧光(NIRF)成像对FGS尤其有利，因为在这一范围内(750-900 nm)组织自身荧光较低，随后能够获得更高的肿瘤与背景比(TBRs)。此外，NIRF成像提供了更好的深度穿透，可以检测到组织表面以下2-4厘米的病变[2］．吲哚菁绿(ICG)是fda批准的唯一NIRF染料，已用于术中识别关键结构，如输尿管[3.和胆管[4]及皮瓣血管灌注的评估[5]及肠段[6］．由于ICG不适合生物偶联，NIRF染料开发的大量努力已经产生了新的试剂，可以很容易地与生物分子结合，用于肿瘤特异性成像。多肽和单克隆抗体(mAbs)一直是FGS探针开发的主要靶向剂，fda批准的单克隆抗体基于其已知的靶向特性和安全性，为临床研究提供了一个快速的途径。值得注意的例子包括FGS联合西妥昔单抗(抗表皮生长因子受体)治疗头颈癌、胰腺癌和恶性胶质瘤[7- - - - - -9]和贝伐珠单抗(抗血管内皮生长因子)治疗胰腺腺癌、乳腺癌和其他几种类型的肿瘤[10，11］．

人表皮生长因子受体2 (HER2)是一种酪氨酸激酶依赖性受体，其表达的扩增与乳腺癌的不良预后有关。HER2在20-25%的乳腺癌中过表达[12从而导致具有临床侵略性的肿瘤。与her2阴性乳腺癌相比，her2阳性乳腺癌历来有较高的复发率和远处转移率，导致预后不良。HER2是一个重要的生物标志物，因为它允许患者使用临床批准的单抗(特别是曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)进行抗HER2治疗，用于局限性和播散性疾病。HER2在无创成像中也发挥着重要作用，应用放射标记的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗类似物进行分期、治疗监测，并通过正电子发射断层扫描(PET)评估原发性和转移性病变的HER2状态[13，14］．抗her2单克隆抗体也用各种染料荧光标记，以评估其对FGS的潜力;然而，使用最临床相关的NIRF染料IRDye800进行生物偶联物开发的两种治疗性抗体之间的直接比较是缺乏的。本研究的目的是评估在体外而且在活的有机体内irdye800标记的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗在具有不同HER2表达水平的乳腺癌细胞系和异种移植瘤中的特性作为临床研究的前奏。

2.材料与方法

2.1.试剂和一般方法

所有试剂均为分析级，使用时无需进一步净化，除非另有说明。Chelex-100树脂购自Bio-Rad实验室(Richmond, CA)，与水缓冲液一起用于放射标记实验，以确保无金属条件。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗来自Genentech (San Francisco, CA)。对照组IgG1抗体，88R20和mAb-69由德克萨斯大学休斯顿健康科学中心的Kendra Carmon博士和Barret R. Harvey博士提供。IRDye800CW-NHS购自LI-COR Biosciences (Lincoln, NE)。Desferrioxamine -p-苄基-异硫氰酸酯(DFO-Bz-NCS)购自Macrocyclics (Plano, TX)。锆- 89 (⁸⁹Zr)-草酸盐由华盛顿大学医学院(圣路易斯，密苏里州)生产。在日立LaChrom分析系统上使用TSKgel G3000SW (5μM)柱和流动相的 磷酸钠缓冲液(pH值7.3)和 (等压:90% A和10% B)和流速为1毫升/分钟。使用先前描述的方法，用放射性薄层色谱(TLC)/高效液相色谱检测系统(LabLogic)测量放化收率和纯度[15］．

2.2.irdy800标记单抗的合成

根据已发表的程序，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗与IRDye800CW-NHS酯结合[16］．简单地说，在二甲亚砜(DMSO)中添加4倍摩尔过量的irdy800 - nhs (5 mg/mL)，加入帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或PBS中对照单抗(2 mg/mL)和0.1 M Na₂有限公司_3.缓冲液(pH值9)。反应在室温下搅拌2小时，并在4℃下继续过夜。用7 kDa分子量截止(MWCO) Zeba脱盐柱从未反应染料中分离产物，并在PBS中收集。用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测定浓度，用HPLC评估纯度。

2.3.双标记单克隆抗体的合成

irdy800 - mab结合物被双标记⁸⁹Zr用于放射性定量吸收研究，根据先前描述的方法[17］．简单地说，在0.1 M碳酸钠(pH 9.0)缓冲液中，每一种荧光免疫偶联物的1 mg与过量8倍摩尔量的DFO-Bz-NCS反应。反应在37°C持续搅拌1 h，并用上述Zeba脱盐自旋柱进行纯化。⁸⁹用等体积的0.5 M HEPES缓冲液稀释草酸锆。在2 N NaOH和37 MBq的溶液中调整放射性溶液的pH为7.4⁸⁹草酸锆加入到100中μ1 M HEPES缓冲液中免疫偶联物各g。37℃加热1 h后，用10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)淬火，用Zeba脱盐自旋柱纯化。放化收率和纯度分别用瞬时薄层色谱法和高效液相色谱法测定。为了确定IRDye-800与mAb的比例以及每个免疫偶联物的DFO分子数量，采用质谱法(Agilent 6538超高清精确质量Q-Tof)。

2.4.细胞系和动物模型

人乳腺癌细胞系SKBR3、BT474和MCF7从美国类型培养集合(ATCC)中获得。细胞在杜尔贝科改良鹰培养基(DMEM)中培养，含10% ( ）胎牛血清(FBS)， 37°C, 95%湿度，5% CO孵育₂的气氛。6-8周龄的无腺雌性nu/nu小鼠(查尔斯河实验室)，根据休斯顿德克萨斯大学健康科学中心的动物护理和使用机构委员会(IACUC)指南进行饲养，并维持正常的啮齿动物饮食。异种移植时，所有小鼠均用1-2%异氟醚麻醉后注射 细胞在100分钟内重新悬浮μ左肩基质:PBS(1:1)。当肿瘤大小达到约5-10毫米的最大直径时进行研究。麻醉过量后颈椎脱位是终末实验小鼠的安乐死方法。

2.5.免疫偶联物的饱和度和结合亲和力

平衡解离常数( ）最大抑菌浓度(IC₅₀)通过直接饱和结合和竞争试验评估免疫结合物的效果。在饱和度研究中，BT474细胞(her2阳性)以 细胞/孔在96孔板中培养，并增加浓度(1.6 ~ 200 nM)⁸⁹Zr-mAb或⁸⁹Zr-mAb-IRDye800在37°C 90分钟。为了测量非特异性结合，放射免疫偶联物与4μM的裸曲妥珠单抗或帕妥珠单抗在其他井。在竞赛研究中，mAb或mAb- irdy800(最终浓度: 来 mg/mL)与12.5 nM的⁸⁹Zr-Trastuzumab或⁸⁹Zr-Pertuzumab加入BT474细胞( 细胞/孔在96孔板)，37°C孵育90分钟。在这两项研究中，培养时间过后，细胞被洗净并重新悬浮在PBS中，并在Wizard中测量总放射性²自动伽马计数器(Perkin Elmer)。

2.6.乳腺癌细胞系的流式细胞术分析

在配备了nirf的BD FACSAria II上，利用流式细胞术研究了irdye 800免疫偶联物在BT474 (her2阳性)和MCF7 (her2阴性)细胞中的结合特性。细胞生长到90%的融合度，并在细胞分离缓冲液中收获。洗完后，一共 细胞在100分钟内重新悬浮μL的生长培养基含有10μg/mL对应的免疫偶联物在4°C孵育30分钟。然后将细胞制成颗粒，用200洗涤三次μL冷FACS缓冲液(PBS, 2% FBS。0.1% NAN3)，在4%多聚甲醛中固定，用PBS洗涤，200重悬μL PBS。同型对照IgG1采用相同的程序，未处理的细胞用于评估背景荧光。在阻滞研究中，细胞与过量10倍的相应非偶联抗体预孵育在4℃下30分钟，成球，用FACS缓冲液洗涤，并进行如上所述的相同过程。

2.7.放射性吸收研究

如前所述，利用放射性吸收研究对免疫偶联物吸收进行定量测量[15］．简单地说，BT474、SKBR3和MCF7细胞被植入96孔板(200,000细胞/孔)，并与含有IRDye800和的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗免疫偶联物10 nM孵育⁸⁹Zr标记在37°C 1 h。为了评估特异性，阻断实验通过与超过100倍的对应亲本(未修饰)单抗共孵育双标记剂进行。然后，细胞被清洗和收集，并在向导中量化放射性²自动伽马计数器(Perkin Elmer)，以确定吸收的总放射性添加的百分比。双标记igg1作为对照进一步证明HER2特异性。孵育的总放射性是从已知的样品中测定的。

2.8.共焦显微镜

为了进一步评估免疫偶联物的结合和随后的内化，进行了免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查。用于免疫荧光染色，BT474细胞在 细胞置于8孔培养载玻片(Falcon)中，并放置过夜。第二天，去除培养基，用PBS清洗细胞，在200℃下培养μL介质含20μg/mL的mAb-IRDye800结合物，在4℃或37℃孵育2小时。孵育结束后，细胞用冰冷的PBS洗涤两次，室温下在4%多聚甲醛中固定10分钟，洗涤两次，并安装含有DAPI的Vectashield (Vector laboratories)。最后，使用共聚焦显微镜(Olympus FV3000)对发射的荧光进行可视化。使用730 nm激光检测ir染料800，使用405 nm激光检测DAPI，并设置适当的滤波器。为了进行阻断研究，BT474细胞与过量10倍的非偶联曲妥珠单抗或帕妥珠单抗预孵育2小时，在4℃或37℃，用PBS洗涤;然后进行类似的免疫荧光研究。

2.9.NIRF成像

在BT474和MCF7异种移植瘤中研究了irdye 800免疫偶联物(单标记)的靶向性和生物分布。动物( -5/组)静脉注射40例μg的曲妥珠单抗- irdy800，帕妥珠单抗- irdy800，或非特异性igg - irdy800，注射后48小时使用In-Vivo Xtreme (Bruker)光学成像系统进行NIRF成像。整个过程中，激发和采集参数都是相同的在活的有机体内而且体外研究:激发(760 nm)，发射(830 nm)，曝光时间(1 s)，视场(19 cm)， f-光圈(0.1)。在完成在活的有机体内成像，小鼠被安乐死和选择的器官被收集和接受体外NIRF成像。使用供应商软件包(分子成像)进行感兴趣区域(ROI)分析，以获得肿瘤与组织的比值(TBRs)。

2.10.组织加工与免疫组化(IHC)

从体外成像研究固定在10%天然缓冲福尔马林24小时室温下，用于制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块。FFPE块在5处连续切片μM厚度，烘干过夜。切片用二甲苯脱蜡，在降低浓度的乙醇中再水化，每个切片用H&E染色。为了确定HER2的表达，使用柠檬酸缓冲液(pH值6.1)对选定的载片进行热诱导抗原提取，然后使用兔特异性HRP/DAB (Abcam)检测试剂盒(IHC)进行免疫组化染色。内源性过氧化物酶阻断30分钟;PBS冲洗后，将载玻片置于潮湿的室中，与一抗(BioGenex)在4℃下孵育一夜。PBS冲洗载玻片，与二抗(生物素化山羊抗兔多价IgG)室温孵育10分钟，然后洗涤，用链霉菌亲和素过氧化物酶处理10分钟。用四盐酸二氨基联苯胺(DAB)溶液观察组织染色5min。在PBS中洗涤后，切片用Mayer’s苏木精(Fisher Healthcare)复染，通过96%和100%酒精的两次变化脱水，在二甲苯中清除，用Cytoseal 60安装介质覆盖(Thermo Scientific)。切片也在奥德赛滑动扫描仪(LI-COR)上成像，以研究在800 nm和最高分辨率下组织内的染料积累模式[18］．

2.11.统计分析

所有实验均为三次重复，结果如下所示 (SD)。放射性吸收研究的组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后采用Holm-Sidak检验进行多重比较。对于离体组织荧光研究，组间比较采用双向方差分析，其次采用Holm-Sidak检验。使用GraphPad Prism 8.0.2版本进行统计分析所有实验均认为< 0.05有统计学意义。

3.结果

3.1.免疫偶联合成和双重标记

将IRDye800偶联到单克隆抗体上，得到纯度为90%的>荧光免疫偶联物，如图所示。1．trastumzumab - irdy800和pertuzumab- irdy800具有相同的HPLC图谱，紫外峰在5.8 min，荧光峰在6.5 min。在紫外印迹上观察到一个小肩，但在荧光通道上没有，表明未标记的单抗有少量聚集。对于双标记单克隆抗体，⁸⁹Zr放射标记的放射化学产率达到>的80%和 (一口无花果。1)．质谱结果显示，单克隆抗体与DFO和IRDye800结合，导致每个抗体约有2个DFO分子。曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800的染料:蛋白质比分别为2和1。

3.2.与HER2的饱和结合和亲和力

直接(饱和)放射配基测定结果表明值⁸⁹Zr-trastuzumab和⁸⁹zr -曲妥珠单抗- irdye 800分别为18.25和26.4 nM。为⁸⁹Zr-pertuzumab和⁸⁹Zr-pertuzumab-IRDye800,值分别为27.69和43.55 nM。这些结果与竞争研究中的结果相似。2而且3.)，并共同表明，IRDye800与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗结合不会显著改变免疫偶联物的结合亲和力和特异性。

3.3.HER2结合的流式细胞术分析

流式细胞术检测单抗与IRDye800偶联后的抗原特异性。与同型对照相比，曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800特异性结合于her2阳性细胞系，荧光强度值增加(图1(一))．正如预期的那样，与HER2密度为负至低(0-1+)的MCF7细胞相比，HER2(3+)高表达的BT474细胞与曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800的结合更高且相似。阻断研究显示，与仅用免疫偶联物培养的细胞相比，预先用裸抗体培养的细胞MFI值明显降低(图1 (b))．荧光强度分析表明，与未结合亲本抗体预孵育后，曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800的结合分别受到约71%和93%的抑制。必威2490这种减少表明免疫偶联物特异性地结合到HER2抗原上，而且它们也能识别与其对应的非偶联抗体相同的表位。

3.4.放射性吸收研究

如图所示2，摄取⁸⁹Zr-DFO-traztuzumab-IRDye800和⁸⁹Zr-DFO-pertuzumab-IRDye800在各细胞系中相似，且与HER2表达水平一致。在BT474细胞中， 而且 添加的⁸⁹Zr-DFO-traztuzumab-IRDye800和⁸⁹分别采用Zr-DFO-pertuzumab-IRDye800。在SKBR3细胞中观察到类似的摄取( 而且 ，)，在MCF7细胞中的积累明显较低( 而且 ，分别)。在相同条件下，在细胞系中未观察到双标记同型对照单抗的显著摄取。用100倍未修饰的单抗阻断研究使BT474细胞中双标记her2靶向示踪剂的结合降低了93%和94%，在SKBR3细胞中降低了97%和88%⁸⁹Zr-DFO-traztuzumab-IRDye800和⁸⁹分别Zr-DFO-pertuzumab-IRDye800。这种细胞摄取的减少表明双标记单克隆抗体在生物偶联后保持了未偶联曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的抗原识别特性。

3.5.共焦显微镜

为了显示irdye - 800结合的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗在结合后保持其促进HER2内化的功能活性，在4°C和37°C对免疫染色的BT474细胞进行共聚焦显微镜观察。在4°C时观察到强烈的膜染色，而在37°C时发生内化(图3.)，表明免疫偶联物成功结合到细胞表面的HER2上，随后BT474细胞将结合的免疫偶联物内化。免疫偶联物与超过其非偶联亲本抗体10倍的竞争抑制了mAb-IR800Dye偶联物的结合和内化，如图所示。4．

3.6.HER2-Targeted在活的有机体内光学成像与吸收分析

在活的有机体内irdye800结合曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的NIRF成像显示，her2过表达的BT474异种移植瘤中，免疫偶联物的肿瘤吸收明显，而在MCF7肿瘤中检测到的信号极低(图4(一)而且4 (b))．注射对照mAb的小鼠未观察到肿瘤相关荧光。由于肝脏对单克隆抗体的吸收和清除，腹部的荧光信号也很明显。体外图像与在活的有机体内结果显示，在非靶组织中没有明显的荧光信号(图4 (c)而且4 (d))．分析体外图像显示在BT474肿瘤中曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800的荧光强度相等，显著高于对照单克隆抗体( ）(图4 (e))．正如预期的那样，与使用her2靶向免疫偶联物的BT474异种移植瘤相比，MCF7异种移植瘤堆积更低(曲妥珠单抗- irdy800的3.06倍和帕妥珠单抗- irdy800的3.81倍)4 (f)．在her2靶向FGS的临床相关位点的正常组织中，低背景吸收的免疫结合物导致TBRs 而且 (乳房脂肪垫)， 而且 (肌肉), 而且 (胃)，对于曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800，分别在BT474小鼠中(图4 (g))．即使在灌注良好的器官，如肺，tbr 而且 分别为曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800，表明在术中检测转移瘤方面具有潜在的实用价值。在MCF7小鼠中，her2靶向单克隆抗体的肿瘤吸收可能是由于增强的渗透性和保留率(EPR)效应，并在某些器官(如肌肉、脂肪垫、小肠和肺)中产生的对比比为>2，但远远低于BT474小鼠获得的值(图)4 (h))．

3.7.肿瘤的组织学和荧光证实及肿瘤内生物结合物的定位

用注射了IRDye800标记单抗的小鼠切除的肿瘤的FFPE切片来评估局部NIRF信号和HER2表达之间的关系，如图所示5．符合在活的有机体内与MCF7相比，BT474肿瘤中her2靶向单克隆抗体的局部摄取更高。组织染色显示，来自NIRF图像的信号局限于有肿瘤组织学证据的区域，并在BT474肿瘤中与抗her2 IHC表现出良好的共定位。肌肉和脂肪垫切片探针摄取显示背景水平荧光，提示曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800的低非特异性结合。注射非特异性同型对照的小鼠切片显示肿瘤组织和非肿瘤组织荧光较低。对于曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800，肿瘤切片定量分析显示BT474肿瘤的荧光信号比MCF7肿瘤高2.2倍(图5 (b)结果，曲妥珠单抗- irdy800的对比比为5.7(肿瘤/肌肉)和4.8(肿瘤/脂肪垫)，而pertuzumab- irdy800的对比比为5(肿瘤/肌肉)和4.3(肿瘤/脂肪垫)。

4.讨论

治疗药物影响临床护理的潜力日益被认识到，特别是在癌症管理方面。在her2阳性乳腺癌中，由于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的协同作用机制，通常在新辅助治疗中与细胞毒性化疗联合使用，以达到完全的病理反应。然而，只有约50%的女性实现了这一理想结果[19并强调了检测残余肿瘤的重要性，包括区域淋巴结。活检可确定肿瘤中HER2的表达，但由于肿瘤间和肿瘤内的异质性，可能无法反映受体的状态[20.，21］．此外，原发性肿瘤和转移性肿瘤活检结果中HER2状态的不一致对患者的管理具有重要意义[22］．肿瘤的无创成像不受这些限制，并从根本上改变了癌症的疾病分期，如前列腺癌和[23，24神经内分泌肿瘤[25，26在治疗乳腺癌方面也显示出了类似的前景。her2表达肿瘤的可视化⁸⁹zr -曲妥珠单抗免疫- pet在2010年首次被报道用于her2阳性转移性乳腺癌患者[27]，并被用于测定her2阴性原发性肿瘤患者的生物标志物表达[28，29]，以及her2阳性胃食管癌患者[30.］．最近，第一个临床评估⁸⁹Zr-pertuzumab在乳腺癌患者her2靶向PET成像中显示出类似的可行性[14］．由于这些单克隆抗体的成像功能主要基于它们已建立的her2靶向特性，这两种试剂都有潜力作为荧光造影剂的基础，指导外科医生在手术室中对通常不可见和无法触及的肿瘤实现边缘阴性切除。考虑到NIRF成像技术在手术室或内窥镜套件中日益增长的整合，这可能特别具有影响力，它改善了手术护理的交付，并使常规应用于开放、腹腔镜和机器人手术。在乳腺手术中使用NIRF成像可能特别有吸引力，因为在这个光谱范围内，来自脂肪和乳腺组织的自发荧光程度较低，而且信号很容易穿透相对低密度的脂肪组织。

尽管曲妥珠单抗和帕妥珠单抗都是治疗her2阳性肿瘤的一线药物，但临床前研究几乎只专注于使用曲妥珠单抗进行FGS研究。据我们所知，唯一经过测试的荧光帕妥珠单抗模拟物在活的有机体内使用红移染料Cy5 (ex/em 651/670 nm)，它缺乏可靠临床应用所需的NIRF发射染料的理想光学性能[31］．Pertuzumab已用于NIRF双标记成像，其中与IRDye800和⁸⁹Zr用于小鼠卵巢癌多模态成像[32］．然而，双标记的单克隆抗体与只荧光的单克隆抗体相比具有不同的化学实体，由于用于放射标记的螯合剂的存在，双标记单克隆抗体可能表现出不同的物理化学性质。根据fda批准的已用于患者FGS的其他单克隆抗体的开发策略[10，33]，由于IRDye800具有优异的光化学性能，本研究采用其作为单一标签[34]，广泛应用于临床研究[7- - - - - -10，35- - - - - -37]，并建立了安全剖面图[38］．考虑到每个单克隆抗体产生肿瘤对比剂所需的染料分子数量较少，我们预计在D/P比为1-2时将IRDye800偶联到单克隆抗体对受体结合效率和特异性的影响最小。这确实被观察到在体外BT474细胞中HER2的摄取最高，HER2在BT474细胞中强烈过表达，且受体介导，流式细胞术研究显示，有无阻塞。双标签⁸⁹Zr允许进一步评估细胞结合，直接比较荧光和双标记类似物的每一个单克隆抗体的结合亲和力使用饱和研究。这些研究结果表明，染料偶联没有明显的影响价值观⁸⁹Zr-labeled马伯。我们还测量了HER2阳性和HER2阴性细胞系中药物摄取的百分比，并发现，与它们的荧光对照物相似，双标记单克隆抗体的摄取与HER2表达相关，如HER2阴性MCF7细胞中显示的低非特异性结合。与过量的未标记单抗共孵育进一步证明了HER2特异性，并表明了药物的适用性在活的有机体内成像实验。

在活的有机体内荧光免疫偶联物成像显示，在注射后48小时，曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800的BT474异种移植瘤中肿瘤定位清晰，而在注射对照单抗的小鼠中未见肿瘤特异性荧光。MCF7肿瘤的肿瘤吸收明显减少，这可能是增强的渗透性和保留(EPR)效应的结果。肝脏摄取也存在的作用，肝脏清除作为主要消除途径的单抗基药物。体外影像学检查结果与在活的有机体内荧光值的定量显示曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800的生物分布几乎相同。因此，her2靶向单克隆抗体的tbr没有明显差异。为了便于从周围脂肪组织中辨别病灶，乳腺脂肪垫的图像对比尤为重要，曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800在该部位的TBR值分别为10.1和9.3。肺是转移性乳腺癌的关键部位，低背景信号导致曲妥珠单抗- irdy800和帕妥珠单抗- irdy800的TBRs分别为8.7和6.9。其他关键器官的tbr为>5，证明了这两种免疫偶联物在手术环境下产生肿瘤造影剂的潜在有用性。尽管NIRF成像仪器和肿瘤模型存在差异，但这些tbr总体上优于其他使用曲妥珠单抗- irdye 800的tbr，并进一步支持其用于FGS [39- - - - - -41］．研究结果也表明，基于其相似特性，帕妥珠单抗可能是治疗her2靶向FGS的有效药物在活的有机体内对曲妥珠单抗- irdy800的性能。此前有报道称，在cy5标记的类似物中，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的肿瘤结合和信号强度之间存在等效性[31];然而，我们的研究是第一次为irdye 800标记的荧光类似物提供这样的证据，因此，非常适合临床应用。在显微镜水平，组织学分析显示，从FFPE切片NIRF读数与免疫组化染色确定的HER2阳性相关。符合在体外而且在活的有机体内在两种肿瘤模型以及肌肉和脂肪垫中，测量组织相关荧光显示曲妥珠单抗- irdye 800和帕妥珠单抗- irdye 800的摄取相同。

曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗her2阳性乳腺癌患者的临床疗效支持了多种基于已证实的靶向性的治疗类似物的转化。这包括fda批准的用于肿瘤靶向化疗的偶联抗体药物曲妥珠单抗伊美坦辛(T-DM1)和试验性放射示踪剂，⁸⁹zr标记曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，用于无创成像。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的荧光结合物通过在手术室提供直接的临床效益将进一步扩展这种治疗范式。具有不同表位特异性的her2靶向FGS制剂的可用性特别重要，因为它使外科医生能够根据所使用的抗her2治疗方案的类型定制FGS方案。FGS药物的选择也可以是治疗方案的补充，而不是完全相同的情况下，新辅助全身治疗的目标耗尽。此外，荧光免疫偶联物可以联合使用，模拟治疗环境，并可能引发增加肿瘤信号强度的附加效应，从而提高检测灵敏度。

5.结论

在本研究中，在具有不同HER2表达水平的细胞和乳腺癌模型中评估曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的IRDye800结合物。观察到高受体特异性在体外而且在活的有机体内两种药剂都有，而且生物分布相似。肿瘤很容易通过NIRF成像显示，在手术相关组织中获得高对比度，如乳腺脂肪垫和肺。这些结果建立在越来越多的临床证据的基础上，这些证据表明使用fda批准的单克隆抗体治疗FGS的效用，并可能改善her2阳性乳腺癌患者的临床管理。

数据可用性

资料可按要求提供。

利益冲突

作者声明，在本文的研究、作者身份和/或出版方面不存在利益冲突。

作者的贡献

Solmaz AghaAmiri和Jo Simien对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

作者披露了本文的研究、作者身份和/或出版获得了以下财政支持:该工作由CHI-Baylor-St。Luke的Phillip Salem癌症基金会奖(HTC/AT)和来自John S. Dunn基金会(AA)的捐赠。作者感谢德克萨斯大学安德森癌症中心的小动物成像设施、UTHealth流式细胞术服务中心和休斯顿卫理公会研究所先进细胞和组织显微镜核心设施的支持。

补充材料

补充图1:曲妥珠单抗- irdy800(左)和帕妥珠单抗- irdy800(右)的高效液相色谱分析使用280 nm, 780 nm和荧光通道。Radio-TLC的⁸⁹zr -trastuzumab- irdy800(左)和⁸⁹Zr-pertuzumab-IRDye800(右)。补充图2:饱和抗原结合试验。直接(饱和)放射性配基结合到(a)的BT474细胞⁸⁹Zr-trastuzumab和⁸⁹zr -曲妥珠单抗- irdy800和(b)⁸⁹Zr-pertuzumab和⁸⁹Zr-pertuzumab-IRDye800。利用Prism Ver. 8.0.2软件将曲线拟合到1位点受体结合模型。补充图3:mAb-IRDye800结合BT474细胞上HER2抗原的竞争结合试验。细胞与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的未偶联或irdye 800偶联(5 × 10⁶到5 × 10^－2mg/mL)，然后用⁸⁹zr标记曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。结果显示，免疫偶联物保留了其抗原特异性和与HER2抗原的结合亲和力。补充图4:BT474细胞与未偶联曲妥珠单抗和帕妥珠单抗预孵育，随后与单抗- ir800dye偶联物共聚焦显微镜图像。结果表明，在4°C和37°C条件下，相应的裸单克隆抗体阻断剂量的存在显著减少了单克隆抗体- irdye 800的结合和内化。补充图5:曲妥珠单抗- irdy800在BT474异种移植组织中的NIRF成像。(a) 48小时的体内成像显示清晰的肿瘤轮廓。(b)所选组织的体外成像证实肿瘤中的选择性堆积和肝脏清除。正常组织中可见微弱信号。补充图6:BT474异种移植瘤中pertuzumab-IRDye800的NIRF成像。(a) 48小时的体内成像显示清晰的肿瘤轮廓。 (b) Ex vivo images of selected tissues confirm selective accumulation in tumors and hepatic clearance. Minimal signal was seen in normal tissues. Supplementary Figure 7: NIRF imaging of IgG-IRDye800 in BT474 xenografts. (a) No tumor-related fluorescence signal was seen 48 h p.i. (b) Ex vivo images showed no notable tumor uptake due to lack of HER2-targeting ability. Minimal signal was seen in normal tissues with the exception of high lung signal in mouse 3. Supplementary Figure 8: NIRF imaging of trastuzumab-IRDye800 in MCF7 xenografts. (a) In vivo images at 48 h p.i. showed negligible uptake of the immunoconjugate in tumors. (b) Ex vivo images of selected tissues confirm in vivo results. Minimal signal was seen in normal tissues. Supplementary Figure 9: NIRF imaging of pertuzumab-IRDye800 in MCF7 xenografts. (a) In vivo images at 48 h p.i. showed negligible uptake of the immunoconjugate in tumors. (b) Ex vivo images of selected tissues confirm in vivo results. Minimal signal was seen in normal tissues. Supplementary Figure 10: NIRF imaging of IgG-IRDye800 in MCF7 xenografts. (a) No tumor-related fluorescence signal was seen 48 h p.i. (b) Ex vivo images showed no notable tumor uptake due to lack of HER2-targeting ability. Minimal signal was seen in normal tissues. Supplementary Figure 11: schematic representation of DFO and IRDye 800 conjugation to trastuzumab. Identical conjugates were prepared with pertuzumab.（补充材料）

参考文献

1. 癌症事实和数据，美国癌症协会，亚特兰大，2019年，https://www.cancer.org．
2. B. Zhu和E. M. Sevick-Muraca，“近红外荧光成像设备在临床研究中的性能综述”，英国放射学杂志，第88卷，no。1045，第20140547条，2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. P. mandova, V. Kalikar和R. V. Patankar，“腹腔镜手术中使用吲哚菁绿的输尿管实时可视化:我们能使手术更安全吗?”外科创新第26卷第4期。4, pp. 464-468, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. J. van den Bos, R. M. scholes, m.d. Luyer等人，“近红外荧光胆管造影辅助腹腔镜胆囊切除术与传统腹腔镜胆囊切除术的比较(FALCON试验):多中心随机对照试验的研究方案，”BMJ开放第6卷第1期。8、文章e011668, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. M. S. Yeoh, D. D. Kim和G. E. Ghali，“荧光血管造影评估皮瓣灌注和活力”，北美口腔颌面外科诊所，第25卷，no。1, pp. 61-66, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. T. Wada, K. Kawada, R. Takahashi等，“ICG荧光成像在腹腔镜结直肠手术结肠灌注定量评价”，外科内镜第31卷第1期。10, pp. 4184-4193, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. S. E. Miller, W. S. Tummers, N. Teraphongphom等人，“首次在人术中使用西妥西单抗- irdy800对胶质母细胞瘤进行近红外荧光成像，”神经肿瘤学杂志第139卷第4期。1, pp. 135-143, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. W. S. Tummers, S. E. Miller, N. T. Teraphongphom等人，“术中使用肿瘤特异性多模态分子成像检测胰腺癌”，外科肿瘤学年鉴，第25卷，no。第7期，2018年第1880-1888页。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. E. L. Rosenthal, J. M. Warram, E. de Boer等，“西妥昔单抗- irdye 800用于头颈癌手术导航的安全性和肿瘤特异性，”临床癌症研究第21卷第4期。16, pp. 3658-3666, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. L. E. Lamberts, M. Koch, J. S. de Jong等人，“荧光贝伐珠单抗- irdy800cw微剂量在原发性乳腺癌患者中的肿瘤特异性摄取:I期可行性研究，”临床癌症研究第23卷第3期。11, pp. 2730-2741, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. K. E. Tipirneni, J. M. Warram, L. S. Moore等人，“适应荧光引导手术的肿瘤程序”，外科年鉴第266卷第1期。1, pp. 36-47, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. “her2阳性乳腺癌的靶向治疗方案及未来展望”信号转导与靶向治疗，第4卷，no。1, 2019年第1 - 22页。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. A. V. F. Massicano, B. V. Marquez-Nostra和S. E. Lapi，“靶向HER2在核医学的成像和治疗，”分子成像， 2018年第17卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. G. A. Ulaner, S. K. Lyashchenko, C. Riedl等，“首次在人类表皮生长因子受体2靶向成像中使用89zr - pertuzumab PET/CT:乳腺癌患者的剂量测定和临床应用，”核医学杂志第59卷，no。6, pp. 900-906, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. S. C. Ghosh, P. Ghosh, N. Wilganowski等，“近红外荧光/核成像的多模态螯合平台”，药物化学杂志第56卷第4期。2, pp. 406-416, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. M. a . Hall, S. Kwon, H. Robinson等人，“用多模式造影剂成像前列腺癌淋巴结转移，”前列腺，第72卷，no。2, pp. 129-146, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. A. Azhdarinia, J. Voss, S. C. Ghosh等，“用免疫pet评价抗lgr5抗体在结直肠肿瘤成像和抗体-药物偶联物的发展”，分子制药学，第15卷，no。6, pp. 2448-2454, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. S. Hernandez Vargas, S. Kossatz, J. Voss等人，“荧光引导手术中生长抑素受体2亚型的特异性靶向性”，临床癌症研究，第25卷，no。14, pp. 4332-4342, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. L.詹尼，T.皮恩科夫斯基，y - h。Im等人，“新辅助剂帕妥珠单抗和曲妥珠单抗在局部晚期、炎症性或早期her2阳性乳腺癌患者中的有效性和安全性(NeoSphere):一项随机多中心、开放标签的2期试验，”柳叶刀肿瘤学杂志第13卷第1期。1，第25-32页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. K. Polyak，“乳腺癌的异质性”临床调查杂志，第121卷第1期。10, pp. 3786-3788, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. G. Turashvili和E. Brogi，“乳腺癌的肿瘤异质性”，医学前沿， vol. 4, p. 227, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. G. Aurilio, D. Disalvatore, G. Pruneri等，“原发性乳腺癌与转移灶间雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2不一致性的荟萃分析”，欧洲癌症杂志，第50卷，no。2, pp. 277-289, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. W. P.芬德勒，J.加莱，M.艾伯等人，《评估⁶⁸Ga-PSMA-11 PET定位复发性前列腺癌的准确性:一项前瞻性单臂临床试验JAMA肿瘤学第5卷第5期。6, pp. 856-863, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. J. B. Nielsen, H. D. Zacho, U. Haberkorn等人，“综合安全评价⁶⁸ga标记的配体前列腺特异性膜抗原11 PET/CT在前列腺癌中的应用:2个前瞻性、多中心试验的结果临床核医学第42卷第4期。7, pp. 520-524, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. R. a . Werner, C. Bluemel, M. Lassmann等人，“基于SPECT和pet的神经内分泌肿瘤患者定制治疗:一种综合多学科团队方法，”临床核医学，第40卷，no。5, pp. e271-e277, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. M. De Jong, W. A. P. Breeman, D. J. Kwekkeboom, R. Valkema和E. P. Krenning，“使用放射标记生长抑素类似物的肿瘤成像和治疗”，化学研究帐目第42卷第4期。7, pp. 873-880, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. E. C. Dijkers, T. H. Oude Munnink, J. G. Kosterink等人，“生物分布⁸⁹zr -曲妥珠单抗和转移性乳腺癌患者her2阳性病灶的PET成像临床药理学和治疗学，第87卷，no。5, pp. 586-592, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. G. A. Ulaner, D. M. Hyman, D. S. Ross等，“her2阴性原发性乳腺癌患者中her2阳性转移的检测⁸⁹Zr-trastuzumab PET / CT。”核医学杂志第57卷，no。10, pp. 1523-1528, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. G. A. Ulaner, D. M. Hyman, S. K. Lyashchenko, J. S. Lewis, J. A. Carrasquillo "⁸⁹zr -曲妥珠单抗PET/CT检测人表皮生长因子受体2阴性原发性乳腺癌患者的人表皮生长因子受体2阳性转移临床核医学第42卷第4期。12，页912-917,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. J. A. O'Donoghue, J. S. Lewis, N. Pandit-Taskar等，“89zr -曲妥珠单抗在食道胃癌患者中的药代动力学、生物分布和辐射剂量测定，”核医学杂志第59卷，no。1, pp. 161-166, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. W. Scheuer, T. Friess, H. Burtscher, B. Bossenmaier, J. Endl和M. Hasmann，“曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合治疗her2阳性人异种移植瘤模型的抗肿瘤活性显著增强，”癌症研究第69卷第1期。24, pp. 930 - 9336, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. H. J. Lee, E. B. Ehlerding, D. Jiang等，“双标记帕妥珠单抗在多模式图像引导卵巢肿瘤切除术中的应用，”美国癌症研究杂志第9卷第1期。7, pp. 1454-1468, 2019。视图:谷歌学者
33. R. W. Gao, N. Teraphongphom, E. de Boer等，“panitumumab-IRDye800CW和西妥昔单抗- irdye 800cw在头颈癌荧光引导手术导航中的安全性，”开展第8卷第1期。9, pp. 2488-2495, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. a . Azhdarinia, P. Ghosh, S. Ghosh, N. Wilganowski，和E. M. Sevick-Muraca，“核和荧光分子成像的双标记策略:回顾和分析”，分子成像与生物学第14卷第4期。3, pp. 261-276, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. 高R. W.， N. T. Teraphongphom, N. S. van den Berg等，“用近红外荧光法测定肿瘤边缘”，癌症研究第78卷第1期。17, pp. 5144-5154, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. M. C. Hekman, M. Rijpkema, C. H. Muselaers等，“肿瘤靶向双模成像改善透明细胞肾细胞癌术中可视化:人类研究的首次”，开展第8卷第1期。8, pp. 2161-2170, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. N. Nishio, N. S. van den Berg, S. van Keulen等人，“panitumumab- irdy800cw荧光引导手术治疗头颈癌的最佳剂量策略，”分子成像与生物学，第22卷，no。1, pp. 156-164, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
38. M. V. Marshall, D. Draney, E. M. Sevick-Muraca和D. M. Olive，“IRDye 800CW在Sprague-Dawley大鼠的单剂量静脉毒性研究”，分子成像与生物学，第12卷，no。6, pp. 583-594, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. 基扬卡;warders, M. el Khattabi等人，“使用抗her2 VHHs位点直接结合IRDye 800CW用于图像引导手术的人类乳腺肿瘤异种移植瘤的快速光学成像。”欧洲核医学与分子成像杂志，第40卷，no。11, pp. 1718-1729, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
40. M. L. Korb, Y. E. Hartman, J. Kovar, K. R. Zinn, K. I. Bland，和E. L. Rosenthal，“单克隆抗体- irdy800cw生物偶联物在乳腺癌切除中的应用”，外科研究杂志第188卷第1期。1, pp. 119-128, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
41. A. G. T. Terwisscha van Scheltinga, G. M. van Dam, W. B. Nagengast等人，“血管内皮生长因子和人表皮生长因子受体2靶向抗体术中近红外荧光肿瘤成像，”核医学杂志第52卷，no。11，第1778-1785页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者

betway赞助

betway赞助版权所有©2021 Solmaz AghaAmiri等人。这是一篇开放获取的文章创作共用授权协议该法律允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是必须正确引用原著。