LIFU通过改善KCC缓解神经性疼痛₂CaMKIV-KCC的表达与抑制₂脊髓L4-L5段的通路

摘要

神经痛(NP)是一种顽固性疼痛，目前缺乏有效的治疗方法。低强度聚焦超声(LIFU)是一种无创的前沿神经调节技术，可有效增强中枢神经系统(CNS)的抑制作用，降低神经元兴奋性。我们研究了LIFU对NP和氯化钾共转运体2 (KCC)表达的影响₂)在周围神经损伤(PNI)大鼠脊髓的腰椎4 -腰椎5 (L4-L5)段。在这项研究中，大鼠在其右小腿接受PNI手术后，从术后3天开始对L4-L5段脊髓进行LIFU刺激，持续4周。我们使用了50%爪子缩回阈值(PWT₅₀)评估机械性异位痛。采用Western blotting (WB)和免疫荧光(IF)方法计算磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV型(CaMKIV)、磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和KCC的表达₂脊髓的L4-L5部分我们发现了PWT₅₀减少( ）pni术后3天在LIFU⁻和LIFU⁺组和增加的( ）LIFU刺激4周后。p-CREB和CaMKIV表达减少( ）和KCC₂增加( ）但p-ERK1/2 ( ）是不受影响。我们的研究表明LIFU可以通过增加KCC的表达来有效地缓解PNI大鼠的NP行为₂脊髓背角神经元。一种可能的解释是LIFU可以抑制CaMKIV-KCC的激活₂途径。

1.简介

神经性疼痛(NP)被定义为源于体感觉系统原发病变和功能障碍的疼痛，可发生在外周或中枢水平[1］．针对这类疼痛已经开展了许多研究，并取得了一些进展，但NP的临床治疗仍存在许多挑战[2］．主要临床表现为自发性疼痛、持续性(或阵发性)疼痛、诱发性疼痛、感觉异常、麻木和刺痛[2，3.］．作为一种难治性和慢性疼痛，可以表现为各种方式，包括慢性腰痛或坐骨神经痛，NP是一个严重的问题。它影响全世界6.9%-10%的人口，严重降低患者的生活质量[2]，增加病人家庭和社会的经济负担[4- - - - - -6］．

NP的病因和机制复杂而不明确。近年来，越来越多的证据表明，下调氯化钾共转运蛋白2 (KCC₂)在NP中起着重要作用。KCC₂是一种存在于中枢神经系统(CNS)成熟神经元中的离子转运蛋白，可以清除Cl⁻从细胞质到细胞外间隙[7］．周围神经损伤(PNI)后KCC的表达₂神经元膜上的Cl浓度下调⁻([Cl⁻］_我)在神经细胞中被上调，从而降低神经递质的抑制作用γ-氨基丁酸[8- - - - - -10］．成熟中枢神经系统的主要抑制性神经递质-氨基丁酸[11]，可与GABA受体(GABA- r)结合，促进突触后神经膜的去极化，介导神经元的超极化和活性[12］．GABA-R的功能障碍最终会减少对脊髓的抑制，导致初级传入神经元的高兴奋性和低阈值机械感觉输入的激活。同时，初级传入神经元在正常情况下只对高阈值(伤害性)输入作出反应，从而引起机械性异位痛和NP [13，14］．通过注射干扰KCC转录的微核糖核酸(miRNA)成功诱导大鼠NP₂，或KCC₂抑制剂(15，16］．所有结果均提示KCC下调₂之后，PNI在NP的发展中发挥了重要作用[17］．许多研究发现增加KCC的表达₂显著缓解NP行为[9，18- - - - - -20.］．因此，学习如何增加KCC的表达₂术后PNI对治疗NP有很大的潜在价值。

PNI后，痛觉刺激导致KCC下调₂脑源性神经营养因子- (BDNF-)原肌凝蛋白受体激酶B (TrkB)通路中通过一系列细胞内级联的表达[21，22］．钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV型(CaMKIV)、磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)和磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)在BDNF-TrkB通路级联的激活和KCC的下调中发挥重要作用₂表达式[10，23，24］．Rivera在转基因小鼠中证实，BDNF激活TrkB受体可进一步抑制KCC的表达₂在转录水平通过 ［23］．近期也有研究发现，PNI或炎症等痛觉可激活脊髓背角的erk -丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路，通过Ras⟶p-ERK1/2级联反应上调细胞内p-ERK1/2表达，抑制KCC的表达₂在转录水平，最终导致NP [23，25，26］．因此，CaMKIV-KCC₂或p-ERK1/2-KCC₂通路在PNI后NP发病中起着至关重要的作用(图1)．

由于NP的作用机制复杂，目前仍没有令人满意的治疗方法[27，28］．在临床层面，传统止痛药如三环抗抑郁药、抗惊厥药、非甾体抗炎药(NSAIDs)、抗癫痫药、弱强阿片类药物等常用于缓解症状，但疗效较差，副作用较多[28- - - - - -30.］．因此，寻找一种适合NP的康复方法具有重要的临床意义。作为一种非侵入性神经调节的形式，低强度聚焦超声(LIFU)已被证实可以安全地调节癫痫患者和动物的大脑活动[31，阿尔茨海默氏症和痴呆[32]，创伤性脑损伤[33]和抑郁[34］．LIFU的神经调节机制包括机械效应、热效应和空化效应[35］．LIFU的机械效应在神经调节中起着重要作用，其机制可能是声辐射通过机械振动迫使细胞膜的双分子结构拉伸，从而干扰细胞膜上机械敏感的离子通道，产生相应的生物效应[36，37］．有趣的是，King等人将LIFU应用于癫痫大鼠的中枢神经系统，发现LIFU可以通过激活中枢神经系统中的GABAergic神经元来抑制异常的癫痫放电[38］．

但LIFU刺激脊髓是否能增强抑制作用，缓解NP尚不清楚。在本研究中，我们将大鼠右胫神经和腓总神经松散结扎，建立PNI模型。在LIFU刺激L4-L5脊髓节段后，我们使用50%爪缩回阈值(PWT₅₀)评估大鼠的机械刺激阈值;采用WB和IF检测p-ERK1/2、CaMKIV、p-CREB和KCC的表达变化₂在腰脊髓。

2.材料与方法

2.1.动物

我们从昆明实验动物中心(中国昆明)共获得40只健康雄性SD大鼠(体重220-300 g)用于实验。所有的老鼠都被安置在 在不同的笼子里(每个笼子5只)进行12小时反光/暗循环试验，并免费获得食物和水。所有动物实验方案均经昆明医科大学动物伦理委员会(No.;KMMU2020352)。

2.2.分组与实验设计

适应期1周后，将大鼠随机分为4组(每组10只):正常组、不手术不治疗大鼠;假手术组，大鼠按PNI手术方法暴露神经，但不结扎;和LIFU⁻集团与LIFU⁺除在LIFU治疗期间超声(US)放大器始终关闭外，其余各组大鼠均并行接受PNI手术和LIFU刺激⁻组。

2.3.NP的PNI模型

我们严格按照文献的要求，采用选择性神经损伤(SNI)方法建立PNI模型[39］．大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。我们在右膝关节近端剃毛并做一个1厘米的切口。肌肉被一层一层地直接分离，然后露出右坐骨神经的三个分支:胫神经、腓总神经和腓肠神经。腓总神经和胫总神经三处以4-0丝松散结扎，间隔1mm。结扎时小心操作，避免损伤腓肠神经。假手术组大鼠右侧坐骨神经支显露但未结扎。

2.4.LIFU刺激L4-L5脊髓部分

在PNI术后第三天开始LIFU刺激，时间范围为09:00 - 15:00(图2(一个))．在使用异氟醚和戊巴比妥钠轻度混合麻醉后，我们将大鼠固定在桌子上，并使用脱毛膏去除它们背上的毛，露出L4-L5脊柱段。换能器固定在此段上，覆盖皮肤，换能器间隙填充超声偶联剂(aqu超声;帕克实验室，费尔菲尔德，新泽西州，美国)无气泡。参数如下:正弦波脉冲频率，4 MHz;占空比(DC)， 20%;脉冲重复频率(PRF) 0.8 KHz;辐照强度0.65 MPa;治疗时间为20 min/d，持续4周。我们用水听器(HNR 0500; Onda, Sunnyvale, CA, USA).

2.5.组织准备

末次LIFU治疗及行为试验后，过量1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)处死大鼠，取组织进行WB ( ）和IF ( ）染色分析。对于WB，我们迅速收集L4-L5脊髓切片组织，并将其保存在−80°C，直到使用。对于IF，大鼠灌流200 ml预冷0.9%生理盐水(4℃)，然后150 ml预冷0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)含有4%多聚甲醛(4℃)。取L4-L5脊髓切片，4℃4%多聚甲醛固定过夜，分别用20和30%蔗糖0.9%生理盐水脱水24 h。嵌入最佳切削温度(OCT)复合材料后，横切面切片(8-12μm厚)的脊髓进行IF或苏木精和伊红(H&E)染色。

2.6.LIFU安全评估

我们进行了H&E染色来评估LIFU对脊髓的安全性。部分准备根据以下程序:固定30年代,在水中清洗5分钟,5分钟的苏木精染色解决方案,在1%酸性乙醇浸渍五次,与伊红染色解决方案2分钟,浸在酒精分级(从高到低浓度)每级5分钟,洗水15分钟,脱水和分级(从低到高的浓度)酒精,在树脂与二甲苯清理,安装。用数码显微镜观察H&E染色结果。

2.7.机械性异位痛的测量

行为测试是由对动物治疗一无所知的研究人员在受控环境中进行的。每只大鼠分别被放置在金属网笼中( ）并在测试前让其适应环境20分钟。我们使用上下法来测试PWT₅₀如文献所述[40］．一系列的von Frey (VF)纤维(Stoelting, Wood Dale, IL, USA)，其硬度(1.4,2.0,4,6,8,10,15和26 g)被用于刺激PNI爪的同侧足底表面。第一个使用的VF灯丝是6g的灯丝，用适当的力使每根灯丝弯曲5 s。舔、举或取下爪子被认为是积极的反应。根据负极或正极的反应，我们用一个更大或更小的力的灯丝。佩恩表的编制者₅₀计算结果如下:

佩恩表的编制者₅₀实验在术前1天进行，在LIFU刺激期间进行1天/周的LIFU前刺激。

2.8.蛋白印迹(WB)分析

脊髓组织(0.1 g)解剖，US匀浆，RIPA缓冲液裂解(RIPA: ）4℃，12000 r/min离心30 min;然后，我们收集上清。总蛋白浓度通过双二酚酸(BCA)检测试剂盒(Biomed, Beijing, China)量化，所有样品均为30μ克/ 10μ1 .样品(总蛋白，30μg)经6%、10%和12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分解，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)。我们用5%脱脂牛奶在室温(RT)下阻塞膜2小时，然后与一抗在4℃轻轻摇动孵育一夜。这些抗体包括抗CaMKIV的单克隆抗体(1,2000;Abcam，剑桥，英国)，p-CREB (1: 1000;细胞信号技术[CST]，美国，p-ERK1/2 (1: 2000;CST)和KCC₂(1: 1000, CST)，以及甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH;1: 50000;ab克隆技术，Woburn, MA, USA)和β-actin (1: 2000;圣克鲁斯生物技术，达拉斯，德克萨斯州，美国)。然后用二抗辣根过氧化物酶(HRP-)标记的抗兔/抗小鼠免疫球蛋白G (IgG) HRP-链接抗体(1:20 00;最后，我们使用增强化学发光(ECL;Tanon，上海，中国)和ImageJ软件(美国国家卫生研究院[NIH]，贝塞斯达，MD，美国)。蛋白质归一化的基础β-actin或GAPDH浓度。

2.9.免疫荧光染色

对于IF，每片切片在RT下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤10分钟，然后与5%山羊血清和0.03% Triton X-100在0.1 M PBS中孵育2 h。然后，我们将切片培养在抗KCC的初级抗体中₂和p-CREB(分别为1:100和1:800;CST)，以及抗NeuN抗体(1:10 00,Abcam)，在4℃过夜。二抗(抗兔IgG[重+轻(H + L)链]，F [ab2个片段[Alexa Fluor 488共轭];抗小鼠IgG [H + L链]，F [ab]2片段[Alexa Fluor 594 Conjugate])在黑暗中RT孵育2 h。PBS洗了三次10分钟后，我们用4 ，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Solarbio，北京，中国)。图像在荧光显微镜下拍摄(奥林巴斯公司，日本东京)。我们使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院[NIH]， Bethesda, MD, USA)来量化阳性区域的密度。

2.10.统计分析

数据以 (SD)。我们使用SPSS 23.0版本(IBM公司，Armonk, NY, USA)进行所有统计分析。GraphPad Prism软件8.0版本(GraphPad software, Inc.， San Diego, CA, USA)用于生成图表。在验证所有数据均为正态分布后，采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)对PWT进行分析₅₀、WB和IF数据。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1.采用L4-L5脊髓切片H&E染色观察LIFU刺激的安全性

横断面放大下未见神经元肿胀、核碎裂、中性粒细胞浸润或出血(图3(一个)×40;数字3 (b)， ×100)的脊髓部分。

3.2.LIFU减轻PNI模型大鼠机械性异位痛

如图所示2(一个)，我们使用PWT₅₀评估LIFU在不同时间对PNI大鼠的刺激效果。LIFU刺激前一天，PWT₅₀显著降低了 (LIFU⁻集团), (LIFU⁺集团) 而且 ，分别为(P<0.05)，但两组间比较差异无统计学意义( )．LIFU刺激后，PWT₅₀逐渐增加，最终在LIFU变得更高⁺集团( ）而不是LIFU⁻集团( ）LIFU刺激3周后( ）并保持稳定直到LIFU刺激结束。然而，正常组和假手术组仍然较低( )，两者之间没有显著差异( ；数字2 (b))．

3.3.LIFU刺激增加KCC₂L4-L5脊髓切片的表达

LIFU刺激4周后，处死大鼠，取L4-L5脊髓切片进行WB(图4(一))和IF(图5(一个))分析。结果表明，KCC的表达₂大鼠体内的蛋白质含量⁺组较LIFU组上调⁻集团( )．正常组和假手术组之间无差异( ；数据4 (b)而且5 (b))．

3.4.LIFU刺激可降低PNI大鼠L4-L5脊髓组织中CaMKIV和p-CREB的表达，但对p-ERK1/2的表达无影响

PNI激活MAPK通路，导致CaMKIV、p-ERK和p-CREB的高表达[41］．在本研究中，WB(图4 (c)- - - - - -4 (h))显示，LIFU中CaMKIV、p-ERK1/2和p-CREB的表达增加⁻组。连续4周LIFU治疗后，CaMKIV和p-CREB表达较LIFU降低⁻集团( ；数据4 (f)而且4 (h))．IF还显示，与LIFU相比，LIFU刺激4周后p-CREB表达降低⁻集团( ；数字5 (d))．有趣的是，p-ERK1/2表达在LIFU间无统计学差异⁻和LIFU⁺正常组与假手术组间CaMKIV、p-ERK1/2、p-CREB表达差异无统计学意义( ；数据4 (d)，4 (f),4 (h))．

4.讨论

氯化钾(K)⁺cl⁻共转运蛋白2₂)是唯一在哺乳动物神经元中表达的阳离子氯共转运体。它在维持低[Cl⁻］_我这是GABA发挥作用所必需的_一个和甘氨酸受体(GlyRs)和介导脊髓抑制[8，10］．鞘内应用KCC后₂抑制剂(2-[[(2S)-2-丁基-6,7-二氯-2-环戊基-1-氧基- 3h -茚-5-基]氧基]，或DIOA)，热诱发的停药潜伏期和无害的刷刺激显著降低[16，42］．我们的实验数据表明KCC₂PNI组表达下调，而PWT₅₀与正常手术组和假手术组相比，本组也较低。所有结果表明，PNI导致KCC下调₂表达，从而削弱GABA_一个/ glyr介导的抑制，然后导致NP [43］．以上这些变化都是NP发展和维持的重要因素。为了进一步研究NP的作用机制，我们发现了提高KCC的作用₂功能:药理学上恢复脊髓抑制和减轻异位痛[9］．在我们的研究中，疼痛行为得到了改善2 (b))和KCC₂表达上调(图4 (b))后4周的LIFU刺激。因此，KCC的表达₂在NP发病中起重要作用，KCC表达上调₂表达可能缓解NP。

PNI之后，KCC的下调₂与激活BDNF-TrkB通路和CaMKIV、p-CREB和p-ERK介导的细胞内级联反应密切相关[21- - - - - -24］．鞘内应用TrkB阻滞剂可显著改善KCC的下调₂炎症性疼痛诱导脊髓背角神经元膜的表达[44］．在Kitayama的研究中，使用短干扰RNA (siRNA)敲除锌转运体-1 (ZnT-1)，导致BDNF-TrkB通路抑制，p-CREB下调，KCC上调₂，以及改善提款门槛[19］．鞘内注射p-ERK阻滞剂后，奥沙利铂所致的大鼠慢性NP也明显缓解[45］．López-Alvarez和Li用电针刺激慢性收缩性损伤(CCI)大鼠，发现电针能有效改善KCC₂表达式、机械退出阈值、热退出潜伏期[18，20.］．因此，CaMKIV、p-CREB和p-ERK介导的BDNF-TrkB通路和级联反应的抑制以及KCC的上调₂表达，可有效缓解NP。在本研究中，我们用LIFU刺激脊髓，证实LIFU治疗NP的疗效。据我们所知，本研究首次使用LIFU刺激脊髓来调节NP。

此外，我们发现CaMKIV和p-CREB下调(图4 (f)，4 (h),5 (d))及KCC₂调节(图4(一)而且5 (b))后LIFU刺激。KCC上调₂表达可降低神经[Cl⁻］_我，增加GABA的作用，增强中间神经元对脊髓的抑制作用，使脊髓感觉神经元的痛阈降低，病理性疼痛行为减轻[7，46］．因此，我们推测LIFU可能通过抑制CaMKIV和p-CREB表达并上调KCC来缓解PNI引起的病理性疼痛₂神经元的表达。

有趣的是，LIFU刺激并没有改变PNI大鼠脊髓中p-ERK1/2的表达(图4 (d))．虽然确切的潜在机制尚不清楚，但有几种可能的解释。首先，在NP大鼠模型中，BDNF-TrkB通路可通过增加Ca浓度激活CaMKIV^{2 +}通过PLC控制神经元γ知识产权_3.而p-ERK是通过TrkB-Ras通路激活的[22，26］．第二，CaMKIV的激活依赖于Ca的浓度^{2 +}在神经元。LIFU的机械力可以影响质膜中的电压门控钙钠通道(VGCCs, VGSCs) [35，47，导致胞内暂时性Ca^{2 +}不同细胞的浓度变化[48］．这种机制可用于间充质干细胞归巢等治疗[36，大脑中的神经调节[47]，或免疫治疗肿瘤US [49］．因此，我们认为LIFU可能通过干扰Ca的瞬时浓度来影响CaMKIV的激活^{2 +}但不影响p-ERK1/2的表达。但具体作用机制尚不清楚，尚需进一步研究。

LIFU作为一种无创神经调节方法，具有空间分辨率高、穿透深度大、不损伤组织等优点[50］．LIFU作为US的一种非热形式，对局部组织有一定的热效应。当外围聚焦US (pFUS; ； ； ）用于体外照射肌肉和肾脏组织时，这些组织的温度分别提高了1.1°C和0.7°C， [36］．在本研究中，我们在L4-L5处切断脊髓，进行H&E染色，观察LIFU对脊髓的安全性。我们的结果显示无肿胀，神经元核碎裂，中性粒细胞浸润或出血(图3(一个)而且3 (b))．因此，这些结果表明LIFU是一种安全的脊髓治疗方法。

综上所述，我们的研究表明:(1)脊髓LIFU刺激能有效改善周围神经损伤引起的神经性疼痛行为，在NP的临床治疗中具有潜在价值;(ii)脊髓LIFU刺激可能影响CaMKIV、CREB和KCC的表达₂；(iii) LIFU刺激脊髓是安全的。

5.限制

我们的研究有一些局限性。首先，我们只确定了一个较短的治疗周期，并没有评估美国疗法的长期疗效。其次，我们只选择了一个时间点来测量CaMKIV、p-CREB、p-ERK和KCC的表达₂．第三，我们发现LIFU可以影响CaMKIV、p-CREB和KCC的表达₂，但我们未能探索其影响上述蛋白表达的具体机制。因此，还需要进一步的实验。

6.结论

我们发现LIFU可以通过增加KCC的表达来有效缓解PNI大鼠的NP₂在脊髓背角。此外，LIFU上调了KCC的表达₂可能是通过抑制CaMKIV-KCC的激活₂途径。

缩写

NP:	神经性疼痛
LIFU:	低强度聚焦超声
句:	周围神经损伤
KCC2：	氯化钾共转运蛋白2
CaMKIV:	钙/钙调素依赖性蛋白激酶IV型
p-CREB:	磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白
p-ERK1/2:	磷酸化细胞外信号调节激酶1/2
GABA:	γ氨基丁酸酸
脑源性神经营养因子:	脑源性神经营养因子
TrkB:	原肌凝蛋白受体激酶B
中枢神经系统:	中枢神经系统
dps:	天时间均
佩恩表的编制者50：	50%撤爪阈值。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

感谢李进教授对本文的语言支持。本研究得到国家自然科学基金项目(no . 81960421, 81660381, 82060421)的资助。我们要感谢LetPub (https://www.letpub.com)，以感谢它在编写本手稿期间提供的语言帮助。

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