Wnt /β连环蛋白通路调节细胞因子在慢性病理神经性疼痛的背根神经节压缩模型

文摘

神经性疼痛是在诊所的重要挑战之一。尽管已经做了很多研究对神经性疼痛(NP)的分子机制仍然是难以捉摸的。我们旨在调查是否Wnt /β造成连环蛋白通路参与了NP维持背根神经节(DRG)压缩与背根神经节的慢性压迫模型(CCD)。我们的核糖核酸测序结果显示,几个Wnt通路相关基因改变了DRG、脊髓背角(SCDH) CCD手术后。因此,我们发现激活的Wnt /β在DRG、SCDH连环蛋白通路,发现活跃β连环蛋白显著调节DRG、SCDH CCD手术后1天,在7 - 14天达到顶峰。免疫荧光结果还证实核translocalization活跃β在DRG、SCDH连环蛋白。另外,大鼠有明显的机械诱导CCD手术后疼痛和疼痛明显缓解后的应用Wnt /β连环蛋白通路抑制剂XAV939。此外,我们发现,促炎因子肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-18(地震)在CCD鼠血清明显升高,而他们的水平Wnt /后相应减少β连环蛋白通路受到抑制。斯皮尔曼相关系数分析的结果表明,肿瘤坏死因子的水平α和地震是负相关的机械撤出阈值(MWT) CCD手术后。总的来说,我们的研究表明,Wnt /β连环蛋白通路NP的发病机制中起着至关重要的作用,可能是一种有效的目标治疗NP。

1。介绍

下腰痛(LBP)是最常见的慢性疼痛疾病,和80%的人一生中经历枸杞多糖。枸杞多糖往往是造成腰孔的狭窄(LFS)和腰椎间盘突出症(LDH),导致运动障碍等症状和NP (1]。在世界的大部分地区,枸杞多糖已成为有限的机动性和失业的主要原因,这给个人带来了巨大的经济负担,家庭和社会2,3]。尽管几十年的调查和巨大的研究努力在NP,特定的细胞和分子机制仍然是难以捉摸的。从以往的研究,我们知道很多流程参与生产和持久性的NP,包括超兴奋性神经元由于神经细胞膜上离子通道的变化如钠离子通道(4),钙通道(5),钾离子通道(6,7),炎症因子积累(8,9),和激活的胶质细胞(10- - - - - -12]。

Wnt /β连环蛋白通路是三Wnt通路之一,和主动β在Wnt /连环蛋白是蛋白质的关键β连环蛋白通路。在缺乏实际上wnt,破坏复杂位于细胞质将绑定活跃β连环蛋白并使磷酸化活性β连环蛋白和蛋白酶体降解β连环蛋白。而实际上wnt绑定使卷曲(Fzd)和LRP5/6细胞膜,破坏复杂将随之瓦解,然后,活跃β连环蛋白不是磷酸化和积累在细胞质中,随后把进入细胞核,活跃β连环蛋白与T细胞/淋巴增强因子(TCF (LEF)转录因子,导致目标基因转录等TNF -α和地震13- - - - - -15]。最近的研究发现,有条件删除Wntless或一个副本β连环蛋白通过Nestin-Cre-mediated重组足以抑制脑源性神经营养因子(BDNF)的表达,一个主要的神经营养因子在哺乳动物16,17]。除此之外,一些研究揭示了Wnt通路中发挥着重要作用的生产和持久性NP,如部分坐骨神经结扎(PSL) [18),脊神经结扎(SNL) [19),和慢性收缩损伤(CCI) [15]。然而,这个途径的作用没有被报道在CCD的模型中,这是最理想的模型来研究这种痛苦,因为它是一个现实的模型,模拟枸杞多糖的病理变化和临床症状(20.]。基于上述研究基础上,我们提出了一个假设的Wnt /必威2490β连环蛋白通路可能使一个重要的影响引起的NP CCD的发病机制。

在我们的研究中,我们第一次发现几个Wnt通路相关基因已发生了显著变化通过RNA序列分析,然后,我们调查的角色Wnt /β连环蛋白途径生成和持久性的NP使用CCD模型这是一个良好的大鼠模型。CCD模型分为单一神经根压缩模型和两个神经根的压缩模型。在这项研究中,我们选择了L4和L5神经根的压缩模型,因为临床上,大部分的LFS和枸杞多糖产生压缩在多个神经根而不是单个神经根(21),所以L4和L5神经根的压缩可以更好地模拟实际的临床情况。我们首先研究了激活Wnt /β随着时间的推移连环蛋白通路在DRG、SCDH CCD-induced NP。之后,我们抑制Wnt /的激活β通过使用XAV939连环蛋白通路在DRG、SCDH,小分子tankyrase抑制剂Wnt /目标β连环蛋白通路的异常活化,抑制Wnt /β连环蛋白通路而不影响正常功能的细胞(22),观察如果CCD-induced有毒可以缓解过敏。XAV939等离子体稳定性良好,可以由腹腔内注射,这是更方便比其他Wnt通路抑制剂(23]。最后,我们探讨了Wnt /的潜在机制β连环蛋白信号生成和持久性的NP。

2。实验程序

2.1。动物

59 SD(雄性SD)中雄性老鼠(220克- 250克体重)从上海Jiesijie购买实验动物有限公司有限公司(中国上海许可证。SCXK(胡)2018 - 0004)。动物被安置在衬垫的笼子里在一个恒定的温度(12:12 h光暗周期),食品辐照的标准实验室(上海Jiesijie实验动物有限公司,中国)和自来水的自由。动物实验和操作是同济医院的动物伦理委员会批准,上海。

2.2。CCD手术

椎间孔狭窄和NP, CCD模型使用。CCD的过程被描述(24),和CCD的示意图如图1(一)。短暂,不到1%戊巴比妥钠麻醉(0.4毫升/公斤,i.p。)和无菌条件下,左L4和L5椎间小孔的老鼠被暴露,然后,两个l型不锈钢棒直径0.6毫米和4毫米的长度是两个椎间小孔插入,分别产生慢性DRG压缩。最后,老鼠放在一个塑料笼后缝合肌肉和皮肤。至于虚假的集团,CCD集团的过程是一样的,但没有不锈钢棒的插入(以上24]。在实验期间,没有发生死亡或自残的老鼠。在第一次手术后一天,老鼠在无关紧要的痛苦行为被排除在外(没有积极回应6 g)。

2.3。药物抑制Wnt /β连环蛋白通路

的抑制剂XAV939 Wnt /β连环蛋白通路(美国Abmole),在10% DMSO / 90% 0.9%生理盐水注射剂量为1.25毫克/公斤腹腔内。此外,假+汽车集团和CCD +汽车集团还收到了注射(200μl 10% DMSO / 90% 0.9%氯化钠)。上面的注射有大约10点钟每天连续七天。必威2490

2.4。评估的参与者

老鼠被放置在一个透明的盒子里测试网格考试当天上午8点,在室温下保持在25°C,适应环境15 - 30分钟。冯·弗雷毛(美国Stoelting)应用,根据前报道(25,冯·弗雷的头发数量被选为描述(26),总之,从0.6克开始,逐渐增加1.0克,1.4克,2.0克,4.0克,6.0克,8.0克,10.0克,15.0 g和26.0 g。唯一的后爪是刺激·冯·弗雷的头发,身体的同侧的一边,只测试了。如果响应是积极的,邻减少·冯·弗雷头发被选为下一个刺激;如果响应是负数,邻增加头发被选中。评估结束时使用克26.0 g的最大数量和响应仍然是负的,或执行测试三次后第一个阳性反应。计算的参与者是分析器被忽视的数据。

2.5。RNA序列和差异表达基因筛选(度)

老鼠与2%戊巴比妥钠麻醉(80毫克/公斤),腹腔内注射后28天CCD,达到全麻醉后斩首。左边L4和L5神经迅速暴露,小心地提取。然后,扩大DRG被切断刀片在冰上。之后,根据腰椎定位的扩大,左脊髓背角的L4-5段被删除。上面所有的组织,分别放置在含有RNA后离心管(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和随后被转移到冰箱4°C。核糖核酸测序完成后由上海Genergy生物技术公司,和一般协议如下:1μl RNA是量化和500 ng RNA是图书馆建设根据量化结果。之后,图书馆使用量子位进行质量检验仪器(美国表达载体)。Illumina公司HiSeq用于测序,仪器NovaSeq 6000(美国Illumina公司)。Deseq2软件(v1.16.1)被用来屏幕为度,和筛选标准值≤0.05和 。

2.6。免疫印迹分析

老鼠与2%戊巴比妥钠麻醉(80毫克/公斤),腹腔内注射,达到全麻醉后斩首。左- 5 DRG、SCDH段均质,分别利用里帕裂解缓冲然后蛋白质样本量化采用BCA化验(Beyotime生物科技、上海、中国)。蛋白质样本10% sds - page分离(Beyotime生物科技、上海、中国)在被加热5分钟在99°C,随后转移到0.45μm PVDF膜(微孔、Billerica MA)。一夜之间,细胞膜被接受初级抗体在4°C,被屏蔽后TBST脱脂牛奶稀释5%,其次是在适当的二次孵化抗体。以下主要使用抗体:兔子anti-activeβ连环蛋白(1:1000稀释;春秋国旅,丹弗斯、马、美国),鼠标反β微管蛋白(1:1000稀释;Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)和辣根peroxidase-linked二级anti-rabbit或anti-mouse抗体(1:1000稀释;Beyotime生物技术,中国上海)。最后,屁股被DRAFT-FluorChem可视化Q(αInnotech公司,圣莱安德罗、钙、美国)和光学密度的乐队是由ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.7。免疫组织化学

老鼠麻醉有1%戊巴比妥钠腹腔内注射(40毫克/公斤)。0.9%生理盐水和4%多聚甲醛是这些麻醉老鼠顺序管理。L4和L5 DRG切除完好无损,随后在4%甲醛固定过夜。这些组织被脱水与梯度蔗糖(10%,20%,30%)和冷冻与10月他们定居在30%蔗糖溶液底部。嵌入完工后,组织切片,背根神经节和脊髓的部分的厚度是10μ米和15μm,分别。接下来,进行免疫荧光染色,步骤如下:在阻塞PBS屏蔽解决方案包含了0.01米的成绩10%山羊血清和0.3% Triton x - 100对1 h在37°C,部分是主要抗体孵育过夜在4°C(兔子anti-activeβ连环蛋白1:800年,微孔),其次是在孵化山羊anti-rabbit Cy3-conjugated二级抗体(1:300稀释,杰克逊ImmunoResearch阿米什人PA) 2小时37°C在黑暗中。随后,部分与核染色染料DAPI(1: 1000稀释,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)7分钟37°C在黑暗中。应用共焦显微镜成像的部分(美国尼康,A1 MP +)和荧光显微镜(美国Ni-U尼康)。

2.8。ELISA(酶联免疫吸附试验)

深与戊巴比妥钠麻醉大鼠(80毫克/公斤)受到从轨道静脉丛血液采集,然后,血液收集是利用离心力分离得到血清在4000 rpm 10分钟在4°C。根据设备详细步骤进行(WESTANG生物科技、上海、中国)指令。光密度(OD)值是衡量DENLEY龙Wellscan可3(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)在450 nm,和所有OD值减去空白值后计算。提升软件Multiskan(美国马热费希尔科学)是应用于绘制标准曲线,和相应的TNF -α和地震-浓度计算根据OD值的样本。

2.9。统计分析

GraphPad Prism 7.0软件(美国CA GraphPad软件Inc .)和SPSS 20.0软件(美国IBM公司,纽约)应用于分析所有数据。数量( )老鼠和统计学意义是表示的数据和图的传说。样本大小是基于以前的经验决定的。双向方差分析是用来分析行为的结果,和单向方差分析应用于分析免疫印迹和ELISA。斯皮尔曼相关系数分析是用来分析参与者之间的相关性和炎症因子水平,包括TNF -α和地震。数据被表示为 (标准差)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。归纳和持久性CCD的异常性疼痛模型大鼠

确认CCD模型成功地和地诱导触觉异常性疼痛(图1(一)),我们进行步态和姿势观察和测量CCD MWT的老鼠。我们发现老鼠步态和姿势异常手术后,如操作的后爪蜷缩,不敢承受的重量。我们测试了在不同时间点大鼠的参与者。结果表明,不断压缩的MWT DRG显著降低后爪和与先前的研究是相一致的27,28),如图1 (b)。的MWT显著降低CCD后第一天,在第7天达到了最低点( )。手术后28天,参与者仍在低水平( )。每个时间点的MWT CCD组低于在虚假的集团( ),虽然没有明显的异常性疼痛是虚假的观察组( )。

3.2。Wnt-Related基因的表达变化的DRG、SCDH CCD

选择一个子集的Wnt通路相关的基因,NCBI基因数据库和豹分类系统的数据库系统。“Wnt通路”作为关键字进行限制搜索“鼠形。“Wnt通路相关的526个基因是基因NCBI数据库中获得。这些数据集的重叠基因和度()的差异表达基因筛选的DRG、SCDH分析使用一个在线工具的维恩图,结果表明,8度和4度DRG、SCDH Wnt通路相关,分别。然后,我们进行基因本体分析豹分类系统数据库系统丰富度的途径参与蛋白质编码DRG、SCDH,发现4度在DRG、1度SCDH Wnt通路相关筛选出来。删除重复基因后,我们筛选出12 4基因在DRG、SCDH,分别(表1)。

3.3。激活Wnt /β连环蛋白诱导细胞因子在DRG、SCDH CCD

DRG、SCDH变化引起的神经损伤的生成和持久性NP至关重要。我们讨论是否Wnt /β连环蛋白通路在CCD大鼠DRG、SCDH已经改变了。活跃的β连环蛋白是一种关键蛋白在这个路径以及是否发生核转位反映是否Wnt /β连环蛋白被激活。因此,我们发现活动的水平β连环蛋白免疫印迹和核易位的活跃β连环蛋白免疫荧光。免疫印迹结果所示,DRG的压缩导致的快速增长活跃的表达β连环蛋白在诊断相关(图2(一个))和SCDH(图2 (b))(1天内)和不断增加( )。都达到了顶峰的表达在7 - 14天,然后逐渐下降。此外,免疫荧光实验表明,经过7天的建模、大量的活跃β连环蛋白阳性染色(红色)被认为是背根神经节(图左侧2 (c))和SCDH(图2 (d))在CCD模型大鼠,阳性染色比虚假的组。Colocalization的活跃β连环蛋白(红色)和DAPI(蓝色)显示活跃的表达β连环蛋白在细胞核中出现CCD老鼠。进一步探索Wnt /的潜在机制β连环蛋白通路影响NP,我们发现TNF的表达水平α和地震- ELISA的血清中促炎细胞因子。结果表明,肿瘤坏死因子的水平α和地震-鼠血清显著增加(第一天 ),7天达到高峰,然后,TNF -α逐渐减少,而地震-保持在一个稳定的水平直到术后28天( )(数据2 (e)和2 (f))。此外,斯皮尔曼相关系数分析的结果表明,肿瘤坏死因子的水平α(斯皮尔曼相关系数:-0.829, )和地震(斯皮尔曼相关系数:-0.943 )与CCD手术后MWT负相关,这意味着更高的肿瘤坏死因子的水平-α地震,老鼠的疼痛越明显,反之亦然,老鼠的疼痛是松了一口气。

3.4。阻塞Wnt /β连环蛋白途径抑制细胞因子的异常性疼痛在CCD的发展

其次,调查是否Wnt /β连环蛋白通路使关键影响神经病理学的发病机理和维护,我们进行腹腔内注射XAV939, Wnt /β连环蛋白通路抑制剂,在CCD老鼠连续七天每天和测试行为变化(时间线如图3(一个))。我们的研究结果表明,XAV939 CCD后可以减轻NP。在5 - 7天的注入,后爪的MWT显著增加( )(图3 (b))。此外,我们确认XAV939抑制Wnt /β通过免疫印迹和免疫荧光实验连环蛋白通路。结果表明,XAV939抑制活性β在DRG、SCDH连环蛋白积累(数字3 (c)和3 (d))。相应地,TNF的表达α地震也显著降低(数字3 (e)和3 (f))当我们抑制这个途径XAV939 ( )。上述结果表明,激活Wnt /β连环蛋白通路影响持久性NP和TNF的表达α地震是由激活的Wnt /βCCD后连环蛋白通路。

4所示。讨论

枸杞多糖是一种最常见的疼痛在诊所。诊断相关机械压缩和化学的刺激可能会导致缺血、水肿、变性DRG、最终导致异常性疼痛的发展29日,30.]。然而,NP的具体机制尚不清楚。我们的研究带来了一个关键角色的Wnt /β连环蛋白通路诱导和延续的NP后慢性压迫神经。主要的研究结果可以归结为以下三个方面:(1)慢性神经压迫导致多个Wnt pathway-related基因的表达变化和快速和持续激活的Wnt /β在DRG、SCDH连环蛋白通路;(2)激活的抑制Wnt /β连环蛋白途径缓解慢性神经压迫引起的异常性疼痛;(3)CCD导致提升肿瘤坏死因子的水平α和地震。肿瘤坏死因子-α与参与者和地震水平显著相关,而阻塞Wnt /β连环蛋白途径降低TNF -的水平α和地震。

Wnt为各种开发过程是非常重要的。Wnt通路首次揭示了科学家在果蝇的发展(31日),是一个关键的信号通路调节神经系统发育,神经元极化,突触可塑性变化,定向生长轴突和树突(32,33]。先前的研究显示,Wnt /β连环蛋白通路被激活在几个NP SCDH模型,如CCI和PSL [15,18]。此外,研究表明,多种炎症因子的水平增加临床患者的血清包括地震和TNF -α(34,35)和疼痛强度与炎症因子的水平(36]。选择TNF -的原因α和地震在许多炎症因子是这两种炎症因子升高不仅疼痛密切相关,而且目标基因密切下游Wnt /β连环蛋白通路(15]。这些研究表明,Wnt /β连环蛋白途径提出了一个重要影响NP的开发和发展,和这条通路的激活可能参与NP的发病机制通过调节肿瘤坏死因子的转录α对疼痛和地震,这是密切相关的。

我们的研究发现,活跃β连环蛋白在DRG、SCDH立即,不断调节CCD模型和免疫荧光结果证实了易位的活跃β连环蛋白在细胞核,可以更直观地观察活跃的本地化β连环蛋白的蛋白质在细胞和更强大的比活性的提取β连环蛋白的蛋白质在细胞核中证明核易位的活跃β连环蛋白蛋白质和Wnt /的激活β连环蛋白通路。这个建议Wnt /的激活β连环蛋白通路持续了很长一段时间,在其他模型(与以前的研究一致15,18]。此外,我们发现,肿瘤坏死因子的水平α和地震- NP密切相关,都大大提高了CCD大鼠的血清;然而,在抑制这个途径,肿瘤坏死因子的水平α,地震也相应的减少。此外,肿瘤坏死因子的水平α和地震- CCD的异常性疼痛时间大鼠有显著相关性。这些结果与阻塞Wnt /β连环蛋白通路可以抑制NP减少地震和TNF水平α。这些结果表明,Wnt /β连环蛋白通路参与NP DRG、压缩后的发展可能会影响NP的转录调节下游炎症因素。神经性疼痛的Wnt通路机制贡献图进行了总结4。

更重要的是,许多学者进行了广泛的NP的机理研究,并相信NP是由周边敏感和中枢敏感化37,38]。周边敏感是指增加初级传入神经元的兴奋性持续异常,导致疼痛信号增加生产(39];中枢敏感化是指在SCDH突触的可塑性变化,和长期的潜力(LTP)突触传递效率的疼痛传输通路(40]。研究表明,Wnt通路可以调节神经元活动活动(41,42]等促进突触的形成和增强突触可塑性在海马体(43,44]。因此,我们推测,Wnt /β连环蛋白途径也可能引起周边敏感和中央敏感神经元兴奋性增加在SCDH DRG、突触强度增加,从而影响NP的进展。

总之,我们的研究带来Wnt /一个关键的角色β连环蛋白通路长期压缩后的生产和持久性NP DRG的光。此外,Wnt /β连环蛋白通路可能诱发NP通过调节肿瘤坏死因子的水平α和地震。此外,它提供了新的目标和新的想法治疗神经压迫的疾病包括LFS和LDH、也可能是一些药物和生物治疗的方法之一,如干细胞发挥镇痛效应。

数据可用性

GraphPad Prism 7.0软件(美国CA GraphPad软件Inc .)和SPSS 20.0软件(美国IBM公司,纽约)应用于分析所有数据。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

YZ, YHM、XMC和DSX设计实验和准备数据。YZ和DZ执行所有的实验。YZ, DZ、XMC和DSX分析数据。所有作者为写作和批准提交的手稿。许你们张是第一作者,东升是第一个共同通讯作者,马竞争和陈Xuemei第三和第二共同通讯作者。

确认

这个工作主要是由中国国家自然科学基金(批准号81772453和81772453)和部分由河南联合支持基金与中国国家自然科学基金(批准号U1704166)。

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