多西环素Hyclate调节抗氧化防御，基质金属蛋白酶和COX-2活性，加速大鼠继发性皮肤伤口愈合

摘要

本研究主要目的是探讨氢化多西环素(Dx)在Wistar大鼠皮肤创面愈合过程中的作用。我们研究了Dx对炎症细胞募集和炎症介质产生的影响在体外而且在活的有机体内分析。此外，我们还分析了Dx在Wistar大鼠皮肤修复中的新生血管、细胞外基质沉积和抗氧化潜力。雄性动物( ）被分为三组，每组5只动物(方案:72/2017)，在动物背部制造3个皮肤伤口(直径12毫米)。各组分别为:C组接受蒸馏水(对照);Dx1，盐酸多西环素(10 mg/kg/天);Dx2，盐酸多西环素(30 mg/kg/天)。每天进行应用，持续21天，每7天从不同伤口取出组织。我们的在体外分析表明，Dx导致巨噬细胞增殖，n -乙酰基-增加β- d -氨基葡萄糖苷酶(NAG)的产生，以及环氧化酶-2 (COX-2)、前列腺素E2 (PGE2)和金属蛋白酶(MMP)的降低，这表明巨噬细胞的激活和COX-2的抑制可能是由独立的机制调控的。在活的有机体内，我们的研究结果显示细胞体积、血管和肥大细胞数量增加。然而，COX-2和PGE2表达下调，局限于表皮细胞。我们的研究结果还表明，这一途径的下调通过减少蛋白质羰基、丙二醛、一氧化氮和过氧化氢(H₂O₂)．此外，在接触Dx后，抗氧化酶(过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)增加，显示了其抗氧化能力。最后，Dx增加了I型胶原蛋白和弹性纤维的数量，降低了MMP的水平，从而加速了皮肤伤口的闭合。我们的研究结果表明，两种剂量的Dx都可以调节皮肤修复过程，但在暴露于最高剂量后观察到最佳效果。

1.简介

皮肤是一个复杂的器官，可作为屏障保护身体免受外界环境的伤害[1］．然而，不同的侵袭因子，如创伤和微生物，可以影响该器官的结构和功能。在病变的情况下，皮下组织暴露，为微生物增殖和定植提供了潮湿和营养的环境[2］．皮肤伤口感染会增加患者的时间化风险，降低生活质量，并导致患者的高死亡率[3.］．皮肤伤口在世界范围内是一个严重的健康问题，往往与高成本和低效且效率有限的治疗有关[4］．目前可用的治疗方法旨在通过促进伤口的快速愈合来改善伤口的愈合。然而，感染的控制通常被忽视[5］．因此，开发控制感染和增加皮肤修复的治疗干预措施是可取的。

皮肤创伤的修复是一个涉及细胞、细胞外基质、血管和组织生长因子之间复杂相互作用的过程。此外，该过程被分为炎症、增殖(肉芽增生)和组织重塑阶段[6］．在炎症阶段，随着细胞介质的释放，白细胞迁移到损伤部位。在增殖阶段，角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞增殖，形成肉芽组织，肉芽组织中也富含血管和III型胶原蛋白[7］．下一个阶段的特征是组织重塑和成熟，其中III型胶原蛋白被I型胶原蛋白取代，从而使疤痕更坚固，更能抵抗机械力[8，9］．

皮肤愈合过程根据其持续时间和性质分为急性或慢性[7］．在一个chronification过程中，COX途径持续激活，中性粒细胞和巨噬细胞释放细胞因子和趋化因子，吸引更多细胞到炎症部位，促进修复组织氧化应激[10，11］．过量的促炎介质增加了过氧化氢(H₂O₂)和氧化氮含量，可加速脂质和蛋白质的过氧化[12］．促氧化介质对皮肤组织造成损伤，延缓伤口愈合过程。因此，控制炎症过程是必要的，以避免自由基和活性氧(ROS)的持续作用造成持续的组织损伤[13］．与此相关，我们可以强调，皮肤愈合环境通常是促氧化的，通常表现为抗氧化酶的合成和表达降低，如超氧化物、谷胱甘肽和过氧化氢酶，这些酶损害了愈合环境[14］．

一般来说，理想的修复过程源于炎症介质和促氧化化合物的合成和降解的平衡过程，从而导致细胞外基质成分，特别是胶原蛋白[15］．基质金属蛋白酶(MMP)通过降解胶原蛋白和非胶原元素，如糖胺聚糖、蛋白聚糖、细胞因子、生长因子及其受体，在细胞外基质(ECM)重塑的翻转中发挥重要作用[16］．然而，MMP的过表达可能导致ECM不受控制的降解，并延迟伤口愈合过程[17- - - - - -19］．因此，MMP调节药物可能对皮肤组织修复产生重要影响，特别是对组织炎症和成熟的影响。在这种情况下，强力霉素(Dx)已经被描述为MMP活性的抑制剂[20.]，其用途已被证实在皮肤修复中调节胶原蛋白的组织水平[21]，刺激胶原蛋白沉积。此外，Dx被证明是抑制促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子- α (TNF-))释放的重要工具α)、IL-6和IL-8 [22］．因此，我们认为Dx可能影响皮肤愈合过程。虽然Dx对各种疾病都有效[23- - - - - -25]，对于Dx在皮肤组织修复中的作用知之必威2490甚少。因此，本研究评估Dx对巨噬细胞活力的影响，监测炎症变化在体外，并使用实验模型了解Dx对大鼠伤口愈合过程中炎症、氧化状态、血管生成和纤维生成反应的影响。

2.材料与方法

2.1.在体外化验

2.1.1.细胞生存能力

采用3-[4,5-二甲基噻唑-2基]-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)法评估RAW264.7巨噬细胞的细胞活力，如前所述[26，27］．细胞在添加10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM中，5% CO加湿培养₂37°C孵化器。为了评价Dx对细胞活力的影响，将RAW264.7巨噬细胞以密度为 细胞/井200μL媒介。24小时后，不同浓度的Dx(10,30,100，和300μg/mL)加入培养基中，在37°C和5% CO下继续孵育24 h₂．对照组(100%的生长)只在培养基中培养细胞。将MTT溶液添加到每个孔中，在37°C下进一步培养细胞2小时。将孵育过程中产生的MTT甲醛溶解在DMSO中，在570 nm处测定吸光度。对于每个样品，结果表示为相对于对照组的吸光度百分比。

2.1.2.用LPS挑战巨噬细胞

在相同条件下培养的RAW264.7巨噬细胞在24孔聚苯乙烯板中，在 每孔取1 mL培养基。24小时后，更换培养基，RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的新鲜培养基中孵育24小时，不含或含100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)和不同Dx浓度(10,30,100和300)μg / mL)。对照细胞用新鲜培养基处理。孵育24 h后，收集巨噬细胞;细胞数量在Neubauer室中通过细胞计数进行量化和调整。细胞用100 mM NaCl/50 mM Tris-HCl缓冲液裂解，离心(在4°C下放置15分钟)。收集培养上清测定前列腺素的产生，MMP、环氧合酶-2和n -乙酰氨基葡萄糖苷酶酶学分析。

(1)金属蛋白酶活性．根据制造商说明书(ABCAM, Cambridge, MA, USA)，使用荧光酶试剂盒测定巨噬细胞匀浆中基质金属蛋白酶的酶活性。MMP活性的测量波长为490 nm/525 nm(激发/发射)，如先前报道[28］．

(2)环氧合酶-2活性．a aliquotμL)的巨噬细胞匀浆用于测量环氧合酶-2 (COX-2)活性，使用生化比色试剂盒进行分析，遵循制造商的说明(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)。酶促测定是基于环加氧酶的过氧化物酶成分，其中过氧化物酶活性是通过监测氧化N,N,N的产生来测定的 ，N -四甲基-对苯二胺，在590 nm处。

(3)前列腺素的产生．根据制造商说明书(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)，用特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒定量巨噬细胞匀浆中的前列腺素E2 (PGE2)水平。简单地说,10μ将L匀浆添加到96孔微孔板中，之前用针对PGE2的特异性抗体增敏。采用412 nm分光光度法测定前列腺素水平[29］．

(4) n -乙酰氨基葡萄糖苷酶活性．在n -乙酰基-定量的基础上，测定RAW264.7细胞的活化β- d -氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性，这是一种由活化的单核/巨噬细胞强烈产生的溶酶体酶[30.］．n -乙酰-β根据制造商说明书(Abcam, Cambridge, UK)，使用商业生化比色试剂盒测定皮肤匀浆中的- d -氨基葡萄糖苷酶活性。该方法使用合成的对硝基苯酚衍生物(R-pNP)作为NAG衬底和释放pNP，用分光光度法在400 nm处测量。

2.2.在活的有机体内化验

2.2.1.动物与伦理

健康3个月大雄性Wistar大鼠15只(鼠形) ( ）均来自Viçosa联邦大学健康与生物科学中心中心。这些动物被随机分配在单独的笼子里，每天进行清洁，并在受控的环境条件下饲养(温度: ，湿度:60-70%，明暗循环:12/12小时)。提供了商业食品和水随意．所有实验均由Viçosa联邦大学动物伦理委员会批准(注册编号:;72/2017)。

2.2.2.外科伤口的程序

腹腔注射戊巴比妥钠(70 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉后，对动物进行背外侧剃须，并用70%酒精清洗该区域。在每只大鼠的背外侧区域用手术剪刀切除皮肤和皮下细胞组织，形成三个直径为12毫米的圆形皮肤伤口。伤口面积用紫色晶体标记，并使用模拟卡尺测量(南美国Mitutoyo Ltda®，São Paulo，巴西)[31］．由于药物的应用会改变细胞的迁移和增殖，损害皮肤修复过程，手术后没有进行镇痛。分别于7天、14天和21天从不同的伤口中提取组织样本，进行组织学和生化分析，如图所示1．

2.2.3.实验设计

动物被随机分为三组，每组5只动物:C(蒸馏水，对照组);Dx1(强力霉素10 mg/kg/天)和Dx2(强力霉素30 mg/kg/天)。灌胃治疗21 d。在此期间，动物被安乐死心脏穿刺和放血后，麻醉程序。剂量是根据在兔模型中使用口服Dx进行角膜再上皮化的研究提供的[32]，通过灌胃给予Dx抑制mmp介导的高血压大鼠血管变化[33］．他们发现许多动物在每天100毫克/公斤的剂量后死亡，这表明强力霉素的治疗窗口可能相当狭窄。因此，我们决定研究与10和30 mg/kg剂量相关的影响，因为研究尚未报道对动物的有害影响。

2.2.4.伤口收缩面积和收缩速度的计算

第三个创面的面积和收缩速度每7天评估一次，使用扫描图像 像素(24位/像素)由华硕Zenfone 2 ZE551ML智能手机(华硕，台北，台湾)获得。按公式计算创面面积 ，在哪里是半径。创面收缩指数(WCI)按以下比值计算: ［34，35］．

2.3.组织学和体视学分析

从伤口中采集的样本，连同病变中心的组织，在组织学固定液中浸泡24小时，乙醇脱水，二甲苯蒸发，石蜡浸泡。组织学切片(4μm厚)在旋转切片机(Leica Multicut 2045, Reichert-Jung Products, Germany)上获得。我们每20个切片取1个，以避免重复分析同一组织区域。切片用苏木精和伊红(HE)染色，分析成纤维细胞和血管[31］．此外，对样品进行天狼星红染色，用于分析I型和III型胶原纤维[36］．用甲苯胺蓝鉴别肥大细胞[37]，用Verhoeff来区分弹性纤维[14］．用BX601光学显微镜(Olympus, São Paulo, Brazil)和QColor-31数码相机(Olympus, São Paulo, Brazil)对幻灯片进行可视化和捕捉。使用20倍物镜随机选择5张图像。的标准测试区域(AT)内包含256个点的网格 被叠加在每张图像上。体积密度的立体学参数( ）通过计算发生在细胞、血管、I型和III型胶原蛋白以及弹性纤维上的点，使用以下比例计算: ，其中PP是发生在感兴趣结构上的点的数量，PT是测试系统上的点的总数[31，38］．胶原纤维根据不同的双折射特性进行分析，厚的胶原纤维(I型)在偏振下呈现从红色到黄色的明亮颜色，而薄的网状纤维(III型胶原)在偏振下呈现亮绿色[31，39］．肥大细胞用40倍物镜分析。在每个组织学切片中随机分析10个显微场，得到总面积(TA)为1.96 mm²．根据该关系计算单位组织面积的肥大细胞数量 ［40］．

2.4.cox - 2免疫组织化学

组织学切片(4μM厚)用二甲苯脱蜡并在蒸馏水中水化。用柠檬酸缓冲液(pH值6)在高压锅中恢复抗原4分钟。切片在3%的过氧化氢中孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶，然后在pH为7.6 TBST (1X tris缓冲生理盐水，0.05%吐温20)的5%脱脂牛奶中孵育15分钟。然后，用兔抗cox -2抗体(ab15191, Abcam, Cambridge, UK)以1:10 00稀释，在4°C下孵育12小时。用TBST清洗载玻片，并在室温下孵育2小时，孵育时使用现成的次级山羊抗兔IgG抗体偶联辣根过氧化物酶(Dako EnVision™+ Dual Link systems - hrp，安捷伦，加州圣克拉拉)。用TBST冲洗载玻片，用0.5% 3,3显示COX-2标记 -二氨基联苯胺5分钟。最后，将载玻片在乙醇中释放，用二甲苯处理，并安装盖玻片。

2.5.生化检测

从每个伤口中收集组织碎片，立即在液氮中冷冻(-196°C)，并保存在−80°C的冷冻室中。样品(200mg)在2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质，在10000下离心5分钟 ，冷藏，在5°C [14］．分别收集上清液和组织颗粒，并用于下面描述的所有生化分析。

2.5.1.环氧化酶-2,n -乙酰氨基葡萄糖苷酶活性，和前列腺素的产生

疤痕组织中环氧合酶-2、n -乙酰氨基葡萄糖苷酶活性和前列腺素E2的产生是在同样的商业试剂盒的帮助下测量的，用于量化这些参数在体外模型。所有测量都是从完整的皮肤(第0天)和伤口愈合后第7、14和21天收集的疤痕组织中进行的。测定组织匀浆上清液中酶活性和前列腺素水平。

2.5.2.过氧化氢和一氧化氮的产生

过氧化氢(H₂O₂)在组织匀浆的上清液中测量产量。50μL上清液与50μL (α-二盐酸苯二胺(OPD)和等体积过氧化物酶型15mmol /L。将吸光度转换为H的微摩尔浓度₂O₂是根据标准曲线计算的，使用已知的H₂O₂．结果表示为μmol / L (41］．

一氧化氮(NO)的间接定量是通过亚硝酸盐/硝酸盐(NO₂^-/不_3.^-)的水平，按标准Griess反应[42］．50μ取1 L上清液，用等体积的Griess试剂(1%磺胺，0,1% N-(1-Naftil)乙二胺，2.5% H3PO4)孵育，室温10分钟。从亚硝酸钠标准曲线(0-125μM)，表示为NO浓度( )．

2.5.3.脂质和蛋白质氧化的测定

根据总丙二醛(MDA)水平估计脂质过氧化(LPO) [43］．MDA浓度采用已知浓度1,1,3,3 -四甲氧基丙烷(TMPO)的标准曲线测定。结果表示为 每毫克蛋白质。

用2,4-二硝基苯肼(DNPH)测定蛋白质羰基含量来估计蛋白质氧化[44]，基于羰基与DNPH反应。从先前提取的组织匀浆中产生的颗粒被用于定量。结果以nmol / mL蛋白表示。

2.5.4.超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性用超氧化物(O₂^-)和过氧化氢还原法，从而减少邻苯三酚的自氧化[45］．SOD活性以每毫克蛋白质的单位计算，一个单位(U)的SOD定义为抑制邻苯三酚自氧化率50%的量。

2.5.5.过氧化氢酶活性

过氧化氢酶(CAT)活性按照Aebi [46]，通过测量过氧化氢的分解速度。以分解1 mmol H的酶数计算CAT活性单位₂O₂1分钟。结果以过氧化氢酶/毫克蛋白质单位表示。

2.5.6.谷胱甘肽s -转移酶活性

采用Habig等方法测定谷胱甘肽s -转移酶(GST)活性。47］．根据谷胱甘肽偶联2,4-二硝基氯苯(CDNB)的形成分析谷胱甘肽s转移酶活性。一个单位的GST活性被定义为催化形成一个GST的酶的量μmol /min/mL。GST活性以每毫克蛋白质U表示。

2.5.7.MMP-10皮肤活性的评价

为了评估MMP-10活性，将200 mg皮肤样品均质于1 mL含有0.15 M NaCl, 10 mM氯化钙的5 mM Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液中₂， 0.02% NaN_3.．离心后，30 min后，收集上清液进行MMP活性分析。为此，根据制造商的说明使用ELISA商业免疫酶试剂盒(Sigma-Aldrich;Merck KGaA，达姆施塔特，德国)。

2.6.统计分析

使用GraphPad Prism 7软件系统(GraphPad software Inc.， San Diego, california, USA)进行统计分析。结果以均数及标准差表示( )．参数数据比较采用单因素方差分析，其次采用Student-Newman-Keuls事后测试。非参数数据比较采用Kruskal-Wallis检验。统计学意义建立于 ．

3.结果

3.1.Dx对巨噬细胞活力、前列腺素产生、COX-2、MMP和NAG活性的影响

Dx对巨噬细胞活力的影响见图2．巨噬细胞暴露于Dx后未观察到细胞毒性。此外，在巨噬细胞与100孵育后观察到最高的细胞增殖μ克/毫升( ）和300年μ克/毫升( ），这表明明显的剂量依赖效应(图2(一个)而且2 (b))．

在在体外分析发现，与CM、Dx10和Dx30相比，Dx也降低了Dx100组的糖蛋白环氧合酶-2 (COX-2)。与NC、CM、Dx10、Dx30、Dx100相比，Dx300组COX2降低。与NC组相比，CM组和Dx组前列腺素E2水平较高(10,30和100)。Dx100相对于CM、Dx10和Dx30呈现下降趋势。与NC、CM、Dx(10、30、100)相比，Dx300呈下降趋势。与NC组相比，CM组、Dx10组、Dx30组、Dx100组金属蛋白酶(MMP)水平下降。与CM、Dx10和Dx30组相比，Dx100组的数值更低。与NC、CM和Dx(10、30和100)相比，Dx300组表现出较低的值。与NC组相比，所有组(CM、Dx10、Dx30、Dx100、Dx300)的NAG值均有所升高(图3.)．

3.2.伤口面积和收缩指数

与对照组相比，Dx1组在第7、14和21天的伤口面积更小，Dx2组在第14天的伤口面积也更小。在第21天，与对照组相比，Dx1和Dx2组的伤口收缩率更高4)．

3.3.组织病理学结果

第7天，与其他组相比，Dx2组组织中总细胞的比例更高。同一天，与对照组相比，Dx1显示出更高的细胞比例。第14天，Dx2细胞比例高于对照组(图5(一个))．在血管方面，与对照组相比，Dx1和Dx2组在第7天血管比例增加。然而，在第14天，与对照动物相比，Dx1组的血管比例减少了。第21天，与对照组和Dx2组相比，Dx1组血管减少(图2)5(一个))．不同组瘢痕组织中细胞和血管的分布情况如图所示5 (b)．

第7天，与其他组相比，Dx2组的肥大细胞数量更高。此外，与对照组相比，Dx1组细胞数量更多(图6(一))．Dx2组第7天瘢痕组织中肥大细胞的分布如图所示6 (b)．

在第21天，与对照组相比，使用Dx1和Dx2治疗的组中I型胶原纤维的比例更高。与对照组相比，在第21天，Dx1和Dx2中III型胶原纤维减少(图2)7(一))．不同组瘢痕组织中I型和III型胶原纤维的分布情况以及Dx处理后I型胶原纤维的优势如图所示7 (b)．在第14天和第21天，与其他组相比，Dx2组的弹性纤维数量更多(图2)7 (c))．第21天，Dx2组瘢痕组织弹性纤维的代表性分布如图所示7 (d)．

3.4.生化结果

3.4.1.免疫组化和COX-2、PGE2、NAG活性

数据8(一个)而且8 (b)显示第7天的COX-2分析结果，与对照组和Dx1组相比，Dx2组的COX-2值较低。这些结果通过显微照片的分析得到了证实，显示COX-2在Dx2中的表达减少，主要是在上皮细胞中。在第7天，与其他组相比，Dx2组的PGE2值较低(图2)8 (c))．与对照组相比，Dx1组和Dx2组的NAG值增加证明了巨噬细胞的积累/激活(图2)8 (d))．

3.4.2.氧化应激标志物

第7天，H₂O₂与对照组相比，Dx1和Dx2组的水平更高。第14天，Dx2 H降低₂O₂与对照组和Dx1组相关的水平。第21天，Dx2 H水平降低₂O₂，与对照组相比(图9(一个))．第14天，与对照组相比，Dx1组和Dx2组的亚硝酸盐和硝酸盐水平较低(图2)9 (b))．在第7天，与对照组相比，Dx1和Dx2组的丙二醛水平较低(图2)9 (c))．另一方面，与对照组相比，在第21天，Dx1组的羰基蛋白水平下降(图1)9 (d))．

3.4.3.抗氧化酶和金属蛋白酶-10

第21天，与Dx2组相比，Dx1组的超氧化物歧化酶活性更高(图2)10 ())．与对照组相比，Dx1和Dx2组过氧化氢酶活性在第7天和第14天更高。第21天，与Dx1组相比，Dx2组CAT活性较低(图1)10 (b))．谷胱甘肽s -转移酶值在试验期间无显著差异(图10 (c))．第14天，Dx2组的MMP-10水平低于Dx1组。第21天，与对照组相比，两组用Dx处理的MMP-10水平均较低(图2)10 (d))．

4.讨论

强力霉素是由四环素衍生而来的一大类广谱抗生素[48］．研究表明，Dx具有与其抗菌活性无关的治疗活性[49，50］．本研究采用综合细胞和组织分析方法，评价Dx口服给药对Wistar大鼠皮肤修复的效果。因此，我们观察到Dx对伤口完全闭合有效，并增加了伤口收缩的速度。这种效应可能与Dx的抗菌和抗炎能力有关[49，51］．这些结果表明，Dx对皮肤损伤有良好的治疗作用。然而，研究该药对皮肤修复作用的研究仍然很少和有限，主要是与其抗氧化能力有关。在最近的一项系统综述中，我们发现抗生素治疗皮肤伤口的积极结果。然而，有有限的证据表明，Dx可以发挥有益的作用，以治疗皮肤病变在活的有机体内［52］．在这篇综述中，磺胺类药物是最常用的抗生素，而强力霉素仅在一项研究中进行了测试[52］．由于Dx暴露后皮肤修复的主要机制尚不清楚，因此需要使用免疫、生化和氧化标记进行研究。

由于其强大的抑菌特性，Dx是一种治疗疾病的有效抗生素，如梅毒[23]、牙周病[24]、肺炎[53]和霍乱[54］．虽然Dx对皮肤修复的影响仍未得到充分的研究，但这种药物可增加胶原沉积[55]，刺激组织再生上皮[20.]有利于清除活性氧，从而防止或减少病理组织破坏[56］．此外，Dx改变炎症细胞的增殖[57］．从这个意义上说，我们观察到Dx促进了巨噬细胞的增殖在体外，发挥潜在的剂量依赖性免疫调节活性。这种效应与巨噬细胞活化的增加相一致，这是由所有剂量Dx诱导的NAG活性上调所表明的。相反，Dx处理的巨噬细胞表现出COX-2和PGE2水平的剂量依赖性下降，这表明巨噬细胞的激活和COX-2抑制是由Dx通过潜在的独立机制调节的，这需要进一步的研究。然而，有证据表明，具有抗菌和抗炎特性的不同药物，如尼美舒利、布洛芬和阿莫西林，可以不同地调节巨噬细胞的活性(即内吞作用和一氧化氮的产生)以及细胞因子和前列腺素的分泌[58- - - - - -60]，这证实了这些代谢过程的相对独立性。因此，Dx对COX-2和巨噬细胞活性的这种特异性作用可能与伤口愈合有关，因为它可以调节炎症反应的强度，而不抑制细胞对抗原刺激的反应，这对感染发挥了重要的保护作用。

此外，我们的结果还显示，疤痕组织细胞的总量增加，突出的是大量的肥大细胞。这主要是在我们使用较高剂量的Dx和在愈合过程的早期阶段观察到的。肥大细胞对于修复过程的炎症阶段很重要，因为它们促进巨噬细胞的激活和肉芽组织的形成、细胞迁移和胶原纤维的成熟[61］．因此，我们认为Dx可以刺激细胞迁移过程，加速伤口闭合，从而降低感染风险。另一方面，我们观察到，在治疗21天后，Dx刺激I型胶原蛋白比例的增加，与III型胶原蛋白比例的低相关。这些特征非常重要，因为高比例的I型胶原纤维增加了组织阻力和力量[62］．这些胶原蛋白纤维呈现共价键，在完好的皮肤中更常见[63］．一般来说，在伤口愈合过程开始时，可以观察到III型胶原蛋白的大量沉积，但随着过程的进展，III型胶原纤维被I型胶原纤维所取代[14]，使组织对牵引力更有抵抗力。必威2490关于弹性纤维，经Dx处理后，瘢痕组织细胞外基质中该纤维增加，尤其在组织重塑的最后阶段。同样，Chung等人也分析了Dx对弹性纤维的作用。[64]，在马凡综合征中，Dx可能通过抑制金属蛋白酶的作用来保留胸主动脉中的弹性纤维。因此，我们的研究结果表明，应用Dx后，细胞增殖能力的诱导，从而合成细胞外基质。

细胞增生和新生血管对伤口愈合过程至关重要，尤其是在炎症期[6］．良好的血管化可以为细胞提供氧气和营养物质，这对损伤组织的恢复很重要[65］．此外，新血管的形成与新基质的形成直接相关，称为肉芽组织，含有丰富的血管和细胞。随着这一过程的推进，血管和细胞的数量减少，但纤维的数量增加，这是成熟疤痕组织的特征[66］．因此，新的有效治疗方法应该在修复过程开始时促进强烈的新血管生成，并在修复过程结束时降低血管水平。Altoé等。[52]，以强力霉素为代表的四环素类增加胶原组织，从而增加伤口的破裂力。我们的研究结果证实了目前的证据，表明Dx在创口过程的开始(第7天)刺激了新血管的增加和细胞数量的增加，这可能是由于NAG的增加同时证明了炎症细胞的强烈迁移和激活。另一方面，观察到血管和细胞减少，而纤维在伤口修复的更高级阶段增加。这些变化对伤口愈合的进化非常重要，并为新组织提供阻力和力量。

有趣的是，Dx也仅在创面愈合的初始阶段(第7天)有效地减弱COX-2活性和PGE2。由于这种抑制同时发生在疤痕组织中细胞数和NAG活性的增加，COX-2活性和PGE2的主要来源似乎与免疫细胞(包括巨噬细胞)招募的增加无关。为了证实这一命题，我们发现用高剂量Dx处理的动物在疤痕组织中COX-2表达减少，这仅限于表皮细胞。因此，我们的研究结果表明，角质形成细胞是dx诱导的COX-2下调的主要靶点，这表明这种作用可能仅限于伤口愈合的初始阶段。从COX-2活性来看，在皮肤损伤后可以检测到高水平的PG，这是一种强有力的促炎效应物，可以吸引免疫细胞，刺激成纤维细胞，以及伤口区域内皮细胞的增殖和代谢[11］．COX-2在花生四烯酸通路中发挥中心和调节作用，通过调节止血和炎症[67]并直接影响伤口愈合后续阶段的发展[68］．因此，控制COX-2下调引起的炎症可能是一个相关的策略，通过Dx加速增殖和重塑阶段的开始，刺激愈合过程的解决。由于COX-2激活介导的PG释放触发了促氧化机制，Dx也可能减弱氧化应激，这可能会由于继发的反应性分子损伤而延长炎症期[49］．

强烈的自由基的产生通常在愈合过程的初始阶段观察到。在皮肤损伤中，吞噬免疫细胞在称为呼吸爆发的过程中产生自由基[69］．自由基、活性氧(ROS)和活性氮(RNS)促进细胞氧化应激，破坏细胞膜、蛋白质和遗传物质[70，71］．关于ROS，重要的是要考虑过氧化氢(H₂O₂)，是氧化还原代谢的重要标志，更常见于愈合过程的炎症阶段[72］．在我们的研究中，不出所料，H₂O₂在使用Dx治疗的组中，在第7天增加，对应于炎症期，但在随后的阶段，在第14天和第21天，在Dx治疗组中减少₂组。在这种情况下，H的过量₂O₂可能发生在嗜中性粒细胞和巨噬细胞的炎症期，由于细胞迁移，它们在吞噬过程中释放介质和活性氧[73］．此外，我们认为，在这一阶段，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的激活发生，产生H₂O₂激活细胞增殖和凋亡。在我们的研究中，我们认为巨噬细胞数量的增加，由在体外而且在活的有机体内NAG分析，可以证明H水平升高₂O₂在早期修复过程中。另一方面，H₂O₂第14天，一氧化氮(NO)水平下降，表明Dx能有效抑制后期的脂质过氧化和蛋白质氧化。然而，过量的NO可引起细胞不可逆损伤，破坏稳态，激活各种信号级联，如丝裂原活化蛋白(MAP)或c-Jun N末端激酶(JNK)，从而引起细胞变性和死亡[74］．一般情况下，由于NO在组织中的半衰期短，很难测量。NO，亚硝酸盐(NO₂)和硝酸盐(NO_3.)是通常使用的标记[75，76］．因此，在我们的研究中，我们测量了Wistar大鼠疤痕组织中亚硝酸盐和硝酸盐的含量。

氧化应激标志物是评估健康和受损组织氧化还原平衡的重要工具[77］．丙二醛是一种由多不饱和脂肪酸过氧化合成的三碳化合物，一般在细胞膜脂质氧化过程中形成[78］．在皮肤修复过程中，MDA通常升高，主要发生在炎症期，这表明组织受损，伤口愈合缓慢[79］．在我们的研究中，我们观察到Dx1和Dx2治疗后第7天MDA水平下降，这表明强力霉素可以帮助积极调节组织在恢复中的氧化还原状态。Nogueira等人也发现了类似的结果。[80]，在惊厥病变诱导后，应用匹罗卡品，从jaborandi叶子中提取的副交感神经生物碱。这些作者表明，Dx减少了大脑中的脂质过氧化，从而保护组织免受自由基的作用。ROS和RNS在组织中作用的另一个重要标志是高含量的羰基化蛋白，这表明蛋白质氧化[66，81］．在本研究中，使用Dx治疗后，仅使用较低剂量，观察到蛋白质羰基化水平降低，表明该药物具有抗氧化的继发作用。Serra等人[82]评估了强力霉素的抗氧化作用，并证明这种药物和其他四环素类似于维生素E，主要是由于存在一个具有多种取代的酚环。该酚环与自由基反应生成酚自由基，酚自由基相对稳定，对细胞成分不起反应[83］．从这个意义上说，Dx除了作为一种抗菌药物外，还具有抗氧化的次级作用，可以保护正在恢复的组织。

为了维持损伤组织中的氧化还原稳态，抗氧化防御系统的作用是必要的，该系统的成分包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽S-转移酶(GST) [84，85］．SOD清除超氧自由基，超氧自由基对细胞具有高度危险和破坏性[86］．CAT酶加速电子的通过，减少H的停留₂O₂在细胞内，从而避免了该化合物对组织的有害影响[87］．这意味着，对于一种被认为能有效治疗自由基引起的病变的药物，它非常希望能刺激这些抗氧化酶的转录和翻译。我们的研究结果表明，Dx增加了组织中的SOD和CAT活性。CAT的增加主要出现在炎症期，这证实了我们关于H₂O₂．我们认为增加SOD和CAT可以降低超氧离子(O₂^-)和H₂O₂，从而保护组织。

胶原蛋白合成与降解失衡是皮肤病变的共同特征，主要发生在感染伤口[88］．这种失衡的一个常见后果是形成增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，导致纤维化和组织功能丧失[8］．基质金属蛋白酶是在急性或慢性皮肤伤口中发现的酶，可调节胶原蛋白的沉积和降解细胞外基质，这对伤口再上皮形成至关重要[19］．这些酶过量可导致上皮组织紊乱，细胞-细胞接触改变，成纤维细胞和角质形成细胞凋亡增加[89］．在我们的研究中，我们观察到MMP的在在活的有机体内在Dx1和Dx2治疗后进行分析，这证实了我们在这些组中伤口面积减小和伤口收缩率增加的发现。为了使愈合过程顺利有效地进行，需要在胶原蛋白的合成和降解之间保持平衡。如果MMP在组织中占主导地位，则可能会发生细胞外基质的恶化，从而影响伤口的闭合[19］．其他研究表明，给药Dx通过抑制MMP-9加速皮肤伤口的闭合[82]，并通过抑制MMP-2和H来加速胃伤口的恢复₂O₂［90］．这种酶的合成平衡是有效的皮肤修复所必需的，可以促进细胞迁移和加速组织的恢复。

5.结论

综上所述，我们的研究结果表明，两种剂量的Dx都可以调节大鼠皮肤伤口的修复。然而，总的来说，暴露于最高剂量的氢化多西环素(30 mg/kg)后，细胞数量、肥大细胞、弹性纤维、过氧化氢水平和金属蛋白酶-10的结果最好。在体外，我们的研究结果显示，Dx增加了巨噬细胞的增殖，但降低了COX-2和PGE-2水平。这表明巨噬细胞活化和COX-2抑制可能是由独立的机制调控的。我们的研究结果表明，在体外，尽管创面愈合初期细胞数量增加，但COX-2表达减少，且局限于表皮细胞。因此，我们的研究结果表明，角质形成细胞是dx诱导COX-2下调的主要靶点，这种在不抑制细胞活化的情况下调节炎症反应强度的能力在愈合过程的有利进化中发挥重要作用。此外，由于COX-2参与了促氧化机制，Dx对这一途径的调节也有利于细胞内的氧化平衡，并保护分子免受自由基的作用，在皮肤伤口修复中显示出抗氧化潜力。这一信息可能与治疗方法的选择有关，主要是在皮肤伤口愈合的急性期。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明，本手稿的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢Fundação do Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG，流程APQ-01895-16, PPM-00687-17和PPM-00077-18)， Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq，流程303972/2017- 3,423594 /2018- 4,305093 /2017-7和MCTIC 408503/2018-1)提供的支持，以及Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior，巴西(CAPES，财务代码001)。

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