海参源肽可减轻成神经细胞瘤细胞氧化应激，提高细胞存活率秀丽隐杆线虫接触过神经毒性百草枯

摘要

当产生的氧化剂超过抗氧化防御机制的能力时，就会产生氧化应激。这可能导致包括癌症和神经退行性变在内的病理状况。因此，人们对具有抗氧化活性的化合物，包括来自自然来源的化合物，产生了相当大的兴趣。在这里，我们对海参蛋白水解物中发现的三种新肽的抗氧化活性进行了表征刺参．在氧化应激条件下，海参肽的合成版本显著补偿谷胱甘肽的消耗，降低线粒体超氧化物水平，并缓解人类成神经细胞瘤细胞的自噬。此外，口服多肽可提高小鼠的存活率秀丽隐杆线虫用百草枯处理后，后者导致过度氧化应激的产生。因此，海参肽在细胞和生物体水平上都具有抗氧化活性，可能被证明是健康衰老的营养补充剂。

1.介绍

由于活性氧(ROS)的产生和中和之间的不平衡，氧化还原稳态的丧失导致细胞内的氧化应激[1，2］．细胞内ROS是细胞器(如线粒体和过氧化物酶体)正常细胞内代谢反应的结果，也是脂氧合酶、NADPH氧化酶和细胞色素P450等胞质酶活性的结果[1，2］．ROS也可以通过外部因素在细胞中产生，包括暴露于照射、化学物质或环境毒素。过量的ROS会破坏DNA、蛋白质和脂类，导致细胞功能障碍，最终导致疾病[3.］．为了对抗和调节ROS水平的升高，动物和植物进化出了复杂的酶和非酶抗氧化防御系统，如过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH) [1］．然而，衰老会导致内源性抗氧化剂的下降，同时ROS或自由基水平的增加会导致与年龄相关的病理，如心血管疾病和神经退行性变[4- - - - - -8］．因此，识别、开发和使用外源性抗氧化剂是对抗上述疾病的一种可能策略[9］．事实上，由于其生理和药理活性，天然生物活性物质，如多肽[10- - - - - -12),多糖(13]和多酚类[14]，在医疗保健和长寿研究中得到了越来越多的关注，更具体地说，已被证明可以缓解氧化应激和与年龄有关的疾病的进展。

多肽是一类具有稳定性、安全性、生物利用度和耐受性的具有吸引力的化合物，可用于筛选新型抗氧化化合物。从不同的自然资源中已经发现了多种生物活性肽。海参纲是海参纲的棘皮动物。在中国，海参作为一种食品补充剂已经有2000多年的历史了。15］．此前的研究也证实了不同海参中含有多种生物活性化合物[16]，含有抗血管生成的药物[17和抗氧化剂[18]属性。特别是，科学家已经成功地从刺参(A. japonicus)中分离出多肽，并证明了它们的抗氧化活性在体外对羟基自由基和超氧阴离子的清除试验[18］．肽提取自答:对虾经纯化的性腺可抑制血管紧张素转化酶，因此，提取的海参提取物可促进心血管疾病的治疗[17］．然而，多肽是否来源于答:对虾维持它们在细胞中的生物活性，如果是这样，它们是如何帮助细胞应对氧化应激的，这在很大程度上是未知的。

在最近的一项研究中，我们水解了蛋白质答:对虾利用线虫进行酶解，测定其抗氧化和抗衰老活性秀丽隐杆线虫，是长寿研究中常用的模型[19］．然后对水解产物进行纯化，并对具有抗氧化活性的组成肽进行鉴定和测序[19］．为了具体分析具有已知序列的单个肽的抗氧化作用，而不是不同肽的混合物，我们合成了单个海参肽的合成版本，并使用各种实验方法在人类细胞和线虫中测试了它们。首先，我们的研究结果显示，暴露于H后，人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5H)中的多肽具有很强的抗氧化活性₂O₂．进一步的研究表明，该多肽可以大幅度减少线粒体中的超氧自由基，保护线粒体不受超氧诱导的线粒体自噬。最后，我们提供了海参肽口服的证据秀丽隐杆线虫还能提高接触百草枯后蠕虫的存活率。

2.材料和方法

2.1.细胞培养

人类成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购自欧洲细胞培养集(ECACC, Sigma-Aldrich)，并在1:1最低必需培养基(MEM) (Sigma-Aldrich)和F-12火腿(Sigma-Aldrich)的营养混合物中生长，其中添加15% FBS (Gibco)， 1%非必需氨基酸，2°mM谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌药(全部为赛默飞世尔科学公司)。细胞在T75或T25烧瓶中培养，在37°C 5% CO下培养₂．细胞保持对数生长期，当符合度达到80-90%时传代(大约每3-4天)。每3天更换一次培养基。常规使用血细胞计和台盼蓝进行细胞计数和活力测定。细胞支原体感染呈阴性。在实验中，根据要求将细胞以适当的细胞密度镀于各种处理过的细胞培养皿中(见结果)。

2.2.多肽合成与分析质谱“，

肽段的鉴定和合成如前所述[20.］．该肽由上海顶肽生物技术有限公司(上海，中国)采用固相合成方法合成，纯度为>95%。

2.3.细胞毒性检测

化合物的细胞毒性是根据制造商的协议，使用MTT或MTS测定试剂盒(Promega)进行比色细胞代谢活性测定。基本上，细胞以10的密度被播种在96孔板中⁴细胞在100年μ每孔L中号。在37°C孵育24小时后，细胞以指示浓度用多肽或对照载体处理(见结果)，并在加入MTS或MTT试剂前进一步孵育72小时。对于MTS试验，25μl MTS试剂直接加入到每孔含细胞的培养基中。培养皿在37°C孵育2小时，然后使用Envision多标签板读取器记录福玛赞染料在506 nm的吸光度。对于MTT试验，细胞处理72 h后，培养基被10μl MTT溶液在PBS (5 mg/ml)和90μl新鲜培养基。37°C孵育4 h后，更换100培养基μl DMSO溶解MTT福马赞。最后，用平板阅读器测量了福玛赞染料在570 nm处的吸光度。

2.4.用CM-H2DCFDA测定氧化应激

SH-SY5Y细胞在96孔细胞培养皿中培养至融合度达到60-70%。细胞被50μM多肽，37°C孵育24 h。作为阳性对照，细胞也处理了50μM谷胱甘肽(GSH)。孵育后，用2 mM H处理细胞可诱导细胞氧化应激₂O₂在37°C下放置3小时。细胞用PBS冲洗三次，然后用1μM CM-H2DCFDA (Invitrogen, C62827)在37°C下浸泡30分钟。SH-SY5Y细胞在Ex/Em 492/527 nm波长下使用Envision多标签板读取器测量荧光强度。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ．错误条显示SD。实验重复三次。

2.5.凋亡和坏死细胞死亡测定

SH-SY5Y细胞在Lab-Tek培养皿中培养，直到融合度达到60-70%。细胞被50μM多肽，37°C孵育24 h。作为阳性对照，细胞也处理了50μM谷胱甘肽(GSH)。孵育后，用2 mM H处理细胞可诱导细胞氧化应激₂O₂在37°C下放置3小时。细胞用PBS冲洗三次，然后用1μl Apopxin绿色凋亡指示μl 7-AAD坏死在37°C下30分钟，然后根据制造商协议(Abcam, ab176749)成像。每个实验中每种条件计算200个细胞，重复3次。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ， ，而且 ．错误条显示SD。实验重复三次。

2.6.细胞内谷胱甘肽的测定

为了测量细胞谷胱甘肽，使用了如所述的氟染料一氯二烷(Sigma) [21］．细胞处理24小时后(见结果)，SH-SY5Y细胞用PBS洗涤三次，用40μM一氯二烷，溶解于37°C的培养基中1小时。然后用PBS冲洗两次，用600处理细胞μM ABAP诱导ROS产生。加入ABAP 1小时后，在Ex记录了单氯二烷的荧光⁴⁰⁵/ Em⁴⁸⁶使用昂科威多标签版阅读器。使用GraphPad Prism软件绘制数据。采用双向方差分析(Two-way ANOVA)和Dunnett多重比较检验(Dunnett’s multiple comparison test)来衡量各处理相对于无肽对照的统计学显著性，以及比较肽浓度对之间的差异。 ， ，而且 ．

2.7.用mitososored测定线粒体超氧化物

为了测量线粒体中的超氧化物水平，使用了MitoSOX Red (Thermo Fisher Scientific)荧光染料。用共聚焦显微镜和流式细胞术测量MitoSOX Red强度。在成像试验中，SH-SY5Y细胞在MatTek公司的玻璃底培养皿中培养，直到达到50-70%的一致性。肽处理和孵育后(见结果)，细胞用PBS洗涤三次，然后用2mm H处理₂O₂(Sigma) 3小时。H₂O₂用PBS冲洗细胞三次后，反应停止。随后，细胞被标记为2μM MitoSOX Red染色30分钟在37°C，然后用共聚焦显微镜成像细胞(Ex⁵¹⁰/ Em⁵⁸⁰)．流式细胞术实验中，除细胞在24孔细胞培养皿中培养外，其余均按上述方法培养和处理细胞。在用MitoSOX Red标记细胞后，用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶化法收获细胞，并以不超过1000细胞/的浓度在PBS中重悬μl.用流式细胞术定量MitoSOX Red荧光强度(Guava, Merck)。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ， ，而且 ；ns:不重要。柱状图使用GraphPad Prism 6软件制作。

为了可视化多肽和溶酶体的共定位，我们使用了定制的结构化照明显微镜(SIM)，提供了接近90纳米的空间分辨率，帧率达到22赫兹[22］．细胞生长在玻璃底的培养皿中，37°C, 5% CO₂的气氛。在成像当天，在持续供气(37°C和5% CO)的SIM系统孵化室中首次稳定培养皿₂)．采用LabView和Matlab编写的软件进行硬件控制和图像重建[23］．对于运动分析和可视化，使用ImageJ。

2.8.Manders系数用于量化线粒体和溶酶体的共定位

活体样品在共聚焦显微镜(徕卡TCS SP5，使用徕卡应用套件(LAS AF))上成像，使用HCX PL APO 40x/1.25-0.75油物镜(徕卡)或HCX PL APO 60x/1.40-0.60油物镜(徕卡)在室温下成像。用于个别实验的荧光剂在图例中有说明。为了量化线粒体中超氧化物积累诱导的自噬程度，我们用1μM爵士溶酶体和1μM维拉帕米(Spirochrome, CY-SC012)，在成像实验期间停留在培养基中。细胞用1μM罗丹明B在37°C和5% CO 30分钟₂在成像前用PBS冲洗三次。共聚焦显微镜收集的图像使用斐济插件Coloc2 (https://imagej.net/Coloc_2)，并用Manders系数来量化线粒体和溶酶体之间的共域程度。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ， ，而且 ；ns:不重要。柱状图使用GraphPad Prism 6软件制作。

2.9.百草枯存活试验秀丽隐杆线虫

百草枯在野生型中进行氧化生存试验秀丽隐杆线虫如前所述[24］．简单地说，同步L1幼虫被放置在96孔板中，每孔密度为25-30只，S培养基中含有大肠杆菌以NA22为饵料，20℃摇晃培养42-45 h至L4期。然后用S培养基清洗L4蠕虫，转移到96孔板，每孔密度15-20个蠕虫，细菌食物和75μg / ml 5-fluoro-2 -去氧尿苷，并与最终浓度为1.0、2.0和4.0 mM的多肽在20°C振荡24小时。接下来，每孔涂抹100 mM百草枯，培养板在20°C的摇动培养箱中再孵育24小时。百草枯暴露后，每12 h记录一次活虫数和死虫数，直至虫体全部死亡。

3.结果

3.1.海参肽是无毒的，具有抗氧化活性，因为他们保护细胞对抗过氧化氢

我们先前从海参的蛋白水解物中发现了新的肽序列(答:对虾)使用质谱法[19］．为了确保后续的实验是用纯材料进行的，我们对确定的肽进行了化学合成，并测试了它们的抗氧化活性(图1(一))．在网上分析表明，所有三个肽序列都是亲水的，TP-WW620、tp - ww621和tp - www -623的GRAVY评分分别为-0.200、-1.125和-0.250(图1)1 (b))．最初，我们使用成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y评估了合成肽的细胞毒性。细胞在37°C下用多肽处理72小时，但我们观察到在所用浓度范围内没有毒性(图1)1 (d))．为了测试其抗氧化活性，我们首先研究了多肽是否能保护暴露于H的SH-SY5Y细胞₂O₂．H₂O₂是一种众所周知的氧化剂，在细胞正常新陈代谢时在细胞内产生[25］．然而,过度的H₂O₂造成严重细胞损伤[26］．在本实验中，我们将细胞在96孔细胞培养皿中孵育24 h或更长时间。然后分别用肽tp - www -620、tp - www -621和tp - www -623对细胞进行独立处理1 (b))溶解于0.5、5.0、50和500浓度的培养基中μM. 24小时后，用PBS洗涤细胞去除多肽，之后600μM H₂O₂在37°C下加入生长培养基4 h。随后，冲洗细胞，用MTT法测定其代谢率。我们发现，尽管暴露于H₂O₂这一效应在三种多肽预处理过的细胞中显著降低(图1 (c))．

3.2.海参源肽降低细胞谷胱甘肽损耗引起的氧化应激

为了研究海参衍生肽是否可以调节细胞中的天然抗氧化水平，我们测量了SH-SY5Y细胞中的GSH。谷胱甘肽存在于动物和植物中，保护细胞免受各种应激，包括氧化应激，谷胱甘肽水平是细胞健康的良好指标。我们使用含氟染料一氯二烷测试氧化应激对活SH-SY5Y细胞中谷胱甘肽含量的影响[21］．

在96孔板中培养的细胞在50℃时用海参肽或谷胱甘肽处理μ米和500μM浓度在37°C下孵育24小时，然后清洗细胞并进一步用40μM单氯丁烷，37°C, 25分钟。然后，细胞用600μABAP (2, 2 -azobis(2-氨基丙烷)二盐酸)增加活性氧的产生[27］．ABAP处理1小时后，在Ex记录细胞的荧光强度⁴⁰⁵/ Em⁴⁸⁶使用昂科威多标签板阅读器(图2)．我们观察到ABAP在PBS处理的细胞中显著降低了GSH的水平，而GSH处理的细胞在两者均为500μ米和50μM浓度显示细胞内GSH水平显著升高(图2)．有趣的是，这三个多肽，都是50μ米和500μ在SH-SY5Y细胞中，M浓度与GSH一样能有效提高GSH的水平(图2)．此外，多肽的作用具有剂量依赖性。此外，我们还评估了多肽是否可以减少H₂O₂对待SH-SY5H细胞。结果在图S1．证明这三种多肽在细胞中都具有抗氧化活性，通过通用氧化应激指标CM-H2DCFDA测定，它们显著减少ROS的形成。总之，这些数据表明海参来源的多肽可以减轻人类成神经细胞瘤细胞的氧化应激。

3.3.海参肽通过降低线粒体超氧化物水平缓解氧化应激诱导的线粒体自噬

氧化应激可引起细胞器功能异常。因此，我们测试了海参源肽对线粒体的抗氧化作用，因为线粒体是细胞中产生ROS的主要来源[28］．线粒体中的超氧化物水平是氧化应激的良好指标，使用可渗透细胞的荧光染料MitoSOX Red来测量[29在活SH-SY5Y细胞中。MitoSOX Red针对线粒体，很容易被氧化产生红色荧光。在本试验中，SH-SY5Y细胞生长在玻璃底的MatTek培养皿中μM肽或50肽μM GSH, 37°C孵育24 h。孵育后，2 mM H对细胞产生氧化应激₂O₂37°C孵育3小时后，用PBS冲洗3次，然后用2μM MitoSOX红色染料30分钟，在37°C。随后，用共聚焦显微镜对细胞成像，观察MitoSOX Red荧光强度的变化(图3(一个))．我们证明用H处理细胞₂O₂单药可增强MitoSOX Red的荧光强度，而在GSH处理的细胞中，这种荧光强度降低。H的加入使超氧化物含量增加₂O₂与H₂O₂与氧化剂清除剂快速反应，从而导致从未完全还原的氧中产生更高的“漏”电子，随后可与分子氧相互作用形成超氧阴离子。有趣的是，我们观察到三种多肽处理的细胞中MitoSOX Red的荧光明显减少(图3(一个))．为了补充成像实验，我们用流式细胞术定量细胞中的MitoSOX Red荧光强度。按照上述成像试验的描述处理细胞，包括用MitoSOX Red染料标记。然后用PBS清洗细胞，通过胰蛋白酶化收集细胞，并在PBS中重悬，用于后续的流式细胞术分析。与成像结果一致，流式细胞术定量显示GSH和所有三种海参肽均显著阻断H₂O₂-诱导的MitoSOX Red荧光强度的增加(图3 (b))．这表明多肽能够抵消线粒体中超氧化物水平的增加。

众所周知，氧化应激会导致线粒体功能障碍并引发线粒体吞噬[30.];因此，自噬是氧化应激的一个后续事件，如果不能减少多余的氧化剂，则会导致细胞更严重的损伤状态。有缺陷或受损的线粒体被细胞清除，这个过程被称为线粒体自噬，在这个过程中，自噬系统最终将线粒体隔离到溶酶体中，在那里它们将被降解。由于多肽可以降低线粒体中的超氧化物水平，我们研究了它们是否可以缓解氧化应激诱导的线粒体自噬。为了检查细胞的自噬程度，我们用罗丹明B标记线粒体，用sir -溶酶体(一种用硅罗丹明标记的组织蛋白酶d特异性肽)标记溶酶体。数字4(一)胞质中溶酶体和线粒体的分布。在没有诱导氧化应激的情况下，只有10%的线粒体(红色)与溶酶体(绿色)共存(图)4(一))，用曼德斯系数分析进行量化(图4 (b))．然而，用H₂O₂，约60%的线粒体与溶酶体共定位(图4)，表明自噬明显增加。线粒体与溶酶体共位的百分比下降，但不明显，当细胞在暴露于h₂O₂与天然抗氧化剂谷胱甘肽(图4(一))．然而，这三种多肽都显著降低了自噬水平(图4)．进一步观察多肽对细胞的保护作用₂O₂治疗细胞(图S3)．H₂O₂可诱导35%的细胞凋亡，17%的细胞坏死。如图所示S3海参肽对细胞的预处理可大大减少细胞程序性死亡。

3.4.海参肽通过胞吞和扩散两种途径进入细胞

尽管本研究中进行的抗氧化活性测定表明多肽被活细胞吸收，但我们试图用成像方法直接演示它们的细胞吸收。为此，我们用荧光染料罗丹明B.稳定地标记多肽，然后SH-SY5Y细胞用标记的多肽处理，并在37℃下培养不同的时间长度。作为对照，细胞也单独用游离罗丹明B染料处理。共聚焦显微镜显示，在5分钟内，培养基中的一部分标记肽已经内化到细胞内囊泡中5(一个))．在30分钟内，细胞内囊泡数量大量增加，显示荧光强度增加，这表明内吞作用是标记肽的主要内化途径。然而，我们也在这些细胞中观察到弱的胞质荧光(图5(一个)(ROI)，这表明一小部分标记肽可以通过穿过细胞膜或从细胞外空间摄取后从内吞囊泡释放而扩散到细胞质中。为了进一步评估在无内吞作用的情况下肽在细胞膜中的扩散，我们将SH-SY5Y细胞在4℃下培养，这会解聚微管，从而阻止内吞作用[31，32]，然后添加标记肽，然后用共聚焦显微镜成像细胞。在这些条件下，观察到明显和均匀的胞质荧光信号。这种荧光信号的强度随着标记肽的浓度而增加(图5 (b))，这表明多肽可以通过质膜扩散到细胞内。在对照实验中，游离罗丹明B在37°C和4°C下迅速扩散到细胞中，并定位到线粒体中，与之前的报道一致[33，34］．

细胞通过内吞作用吸收的分子要么被回收回细胞表面，要么在晚期核内体或溶酶体中进一步加工[35］．为了验证标记肽是否通过内吞途径转运到溶酶体，我们用LAMP1-GFP标记溶酶体，然后用罗丹明b标记肽处理这些细胞。时间过程成像显示，每个标记肽的大部分快速定位在溶酶体内，并在肽添加后的第3天饱和(图6和图S2)．通过SIM对内化肽的进一步研究显示，肽在溶酶体腔内富集(图6(b)和视频1)．

3.5.海参源肽能提高海参的存活率秀丽隐杆线虫暴露于百草枯

我们在活细胞中的实验表明，这三种多肽具有抗氧化活性，它们可以减少氧化应激的毒性，甚至在细胞器水平。我们接下来想要研究的是，这些多肽在缓解整个生物体氧化应激毒性方面是否同样活跃。为了达到这个目的，我们使用了线虫，秀丽隐杆线虫，是一种模式生物，广泛用于研究衰老和与年龄有关的疾病[36，37］．生存在秀丽隐杆线虫因接触百草枯而严重受损，百草枯是一种有毒氧化剂，会在细胞中产生过量的超氧阴离子[24，38］．我们测试了多肽是否减轻百草枯毒性秀丽隐杆线虫通过测量线虫的存活率。同步的l1期野生型蠕虫在96孔培养皿中(每孔约25-30只)在20°C下生长到L4期。L4蠕虫与最终浓度为1.0、2.0和4.0 mM的多肽在96孔板中(每孔约15-20只蠕虫)在20°C下孵育24小时，然后在20°C下用100 mM百草枯孵育24小时。然后，每12 h对活虫和死虫进行评分，直至全部死亡。存活率分析表明，与百草枯处理的对照相比，多肽处理在不同程度上提高了蠕虫的存活率，其中TP-WW-620表现最好(图7)．这些观察结果秀丽隐杆线虫补充我们在成神经细胞瘤细胞中的细胞分析结果，并进一步验证多肽的抗氧化活性。

4.讨论

将自然资源用于医药或一般保健产品的一项主要挑战是其复杂性，因为它们是多种成分的混合物，这使其生物活性的详细表征复杂化[39］．在目前的研究中，我们通过合成最初在海参复杂蛋白水解物中识别的单个肽序列，解决了第一个问题答:对虾．这使我们能够解决第二个问题，而不必担心复杂混合物中的哪些成分负责任何相关的生物活性。因此，我们能够通过不同的实验方法在人类细胞系和线虫中测试三种个体肽的抗氧化活性秀丽隐杆线虫．我们的结果显示，这三种多肽都是从之前筛选的强抗氧化剂候选物中筛选出来的[19]，降低H₂O₂治疗(图1 (c))和支持氧化应激条件下谷胱甘肽的功能(图2)．我们还证明，海参来源的多肽在细胞器水平上是活跃的，因为它们减少了线粒体中的超氧化物水平，从而阻止了自噬，这从肽处理细胞中线粒体的溶酶体吞噬减少得到了证明。此外，细胞摄取实验(图5)显示，大部分多肽通过细胞内吞作用被细胞吸收，并被困在溶酶体中(图6)．尽管溶酶体是众所周知的内吞降解物质的最终目的地，但有报道称溶酶体可分泌小肽[40，41］．除此之外，我们还在细胞质中检测到一小部分多肽(图5)，这可能是通过质膜被动转运和/或从内吞囊泡释放。在最后的实验中，我们发现多肽不仅可以缓解细胞模型的氧化应激，还可以提高存活率秀丽隐杆线虫暴露于百草枯。

谷胱甘肽的抗氧化活性源于其半胱氨酸残基，其硫醇基易氧化，因此可作为还原剂[42，43］．除半胱氨酸外，被评价为抗氧化剂的氨基酸有蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸和苯丙氨酸[44- - - - - -46］．我们合成的肽含有一个或多个氨基酸(图1 (b))，因此在我们测定的抗氧化活性中起着重要作用。因此，与谷胱甘肽类似，合成的多肽可能具有直接的生化作用，作为还原剂保护细胞免受氧化应激。

除了这种直接减少ROS，肽功能的另一种可能机制可能是通过诱导调节细胞氧化应激的细胞信号应答。在应对氧化应激时，细胞中激活的主要信号通路有丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号级联，磷酸肌醇3激酶(PI3K)或Akt通路，核因子NF-κB信号、p53激活和热休克反应[47］．一种可能的情况是，当细胞在氧化应激诱导之前用合成多肽处理时，上述信号通路被激活，导致细胞恢复力的增加，从而在氧化应激发生时，它们能够更好地抵御氧化应激。这与已有的抗氧化药物筛选策略是一致的，例如，候选药物的选择是基于诱导细胞内HSF1表达的能力[48］．我们的数据表明多肽可以减少H₂O₂全身mitophagy(图4)表明Akt信号通路被激活，这是自噬过程中一个重要而活跃的通路[49，50］．后一个结果也与我们的线虫实验一致，我们显示百草枯暴露的影响，导致线粒体功能障碍和减少存活秀丽隐杆线虫，可通过用多肽预处理蠕虫来减少7)．信号通路的参与可以通过使用药理抑制剂或激活剂，例如Akt通路，以及氧化应激条件下细胞的肽处理来检测[51，52］．因此，未来研究这些多肽是否可以激活防御氧化应激的细胞反应途径将是很有趣的。

总的来说，我们已经证明了某些海参源肽在细胞和生物体水平上都具有抗氧化活性，并对它们的基本作用模式提供了一些见解，包括摄取机制、线粒体超氧化物水平的降低和线粒体自噬的缓解。海参在中国、日本和其他国家传统上被用作保健食品和治疗药物，在这些国家，海参被认为可以延缓衰老、增强记忆力和抗疲劳。

我们的研究结果表明，多肽有潜力用于与年龄相关的疾病的营养补充剂，以及一般的健康维护，也验证了在天然原料中发现新的生物活性化合物的模型策略。

数据可用性

评估论文结论所需的所有数据都在论文和/或补充材料中。与本文相关的其他资料可向通讯作者索取。

信息披露

Ajay Mishra目前的地址是英国剑桥郡Hinxton惠康基因组校区欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)。Chiara Bochetti目前的住址是普利茅斯大学德雷克广场生物与海洋科学学院，普利茅斯德文郡PL4 8AA英国。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

m.l.、a.m.、a.t.、C.F.K和G.S.K.S.构思了这些想法，设计了实验，并分析了数据。M.L.和A.M.进行了实验。m.l.， a.m.和C.B.分析了数据。J.L.， Y.L.， H.H.和Z.H.对肽进行了鉴定，并制备了肽的合成版本。m.l.， a.m.， a.t.和G.S.K.S.撰写了手稿。所有作者都对结果进行了讨论和评论。Lu和Ajay Mishra对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

我们感谢Ana Fernandez-Villegas博士和Wei Li对细胞培养的帮助。本研究由无限极(中国)有限公司资助;G.S.K.感谢来自维康信托基金、英国医学研究委员会(MRC)和英国阿尔茨海默病研究(ARUK)的资助。z.b.h感谢111项目(B17018)的资助。

补充材料

图S1:海参源肽降低H₂O₂处理细胞。SH-SY5Y细胞在96孔细胞培养皿中培养至融合度达到60-70%。细胞被50μM多肽，37°C孵育24 h。作为阳性对照，细胞也处理了50μM谷胱甘肽(GSH)。孵育后，用2 mM H处理细胞可诱导细胞氧化应激₂O₂在37°C下放置3小时。细胞用PBS冲洗三次，然后用1μM CM-H2DCFDA在37°C下浸泡30分钟。SH-SY5Y细胞在Ex/Em 492/527 nm波长下使用Envision多标签板读取器测量荧光强度。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ．错误条显示SD。实验重复三次。图S2:海参源肽与溶酶体共域。SH-SY5Y细胞溶酶体用LAMP1-GFP标记，然后用50μM罗丹明b标记肽tp - wwl -620, tp - wwl -621和tp - wwl -623在37°C。显示的是第3天记录的细胞图像，以说明多肽和溶酶体的共化水平。图S3:海参源肽对凋亡和坏死细胞死亡有保护作用。SH-SY5Y细胞在Lab-Tek培养皿中培养，直到融合度达到60-70%。细胞被50μM多肽，37°C孵育24 h。作为阳性对照，细胞也处理了50μM谷胱甘肽(GSH)。孵育后，用2 mM H处理细胞可诱导细胞氧化应激₂O₂在37°C下放置3小时。细胞用PBS冲洗三次，然后用1μl Apopxin绿色凋亡检测指示剂μl 7-AAD坏死分析，在37°C下30分钟，然后根据制造商的成像方案。每个实验中每种条件计算200个细胞，重复3次。采用Tukey单因素方差分析确定差异有统计学意义。 ， ，而且 ．错误条显示SD。实验重复三次。视频1:SIM活细胞成像显示溶酶体内多肽的动态运动。表达LAMP1-GFP的SH-SY5Y细胞内溶酶体(绿色)内的多肽(洋红色)在45秒内以1.5秒/帧的速度成像。（补充材料）

参考文献

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