对抗模拟微重力对H9C2心肌细胞氧化应激的保护策略

摘要

微重力会影响人的心血管功能，引起心律紊乱甚至心脏萎缩。微重力引发的机制和保护策略的探索在体内难以研究。本研究旨在探讨模拟微重力对心肌细胞样表型的影响。随机定位机(RPM)，设置在CO₂培养箱模拟微重力，H9C2细胞系作为心肌细胞样模型。H9C2细胞暴露在模拟微重力下长达96小时，与在地球重力下生长的细胞相比，显示出较慢的细胞增殖速度和较低的代谢活性。在暴露细胞中，伴随这些作用的是细胞内活性氧(ROS)、胞质钙水平的增加^{2 +}、线粒体超氧阴离子。蛋白质羰基，蛋白质氧化的标记物，在RPM中第一个48小时后显著增加。在这些条件下，抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸(NAC)的存在抵消了模拟微重力引起的影响。总之，这些数据表明模拟微重力引发细胞内ROS和Ca的同时增加^{2 +}水平和影响细胞代谢活动，这反过来可能是造成增殖速率较慢的原因。然而，可检测到的死亡细胞数量非常少，更有趣的是，NA的保护作用，证明模拟微重力并没有“不可逆的毒性作用”，而是影响氧化平衡，导致增殖的短暂放缓。

1.简介

地球上引力的存在深深地影响了生物的进化，在过去的一个世纪里，人类空间活动为理解低重力环境(微重力)对生物体的影响带来了新的科学挑战。微重力在细胞以及器官或系统层面影响生物有机体的许多特征和功能[1］．宇航员在轨道上维持卫星和在国际空间站(国际空间站)的持久性需要注意重力变化对人体的影响。从这个角度来看，对肌肉和骨组织的影响引起了人们的极大兴趣，以开发减缓太空中肌肉骨骼衰退的对策[2，3.］．同样重要的是，在空间飞行期间暴露在微重力下会引起人类心血管系统的变化，包括液体转移、收缩容积的变化，以及长期暴露在微重力下后左心室质量的减少[4- - - - - -6］．对长期暴露在微重力下的宇航员的临床评估也记录了心脏电资产非常频繁的变化，增加了心律失常的倾向[7- - - - - -9］．即使心律失常的某些方面可以用适应微重力引起的交感神经和迷走神经失衡来解释，但在细胞水平上，也有报道称钙处理的改变可能与收缩和心律失常有关[10，11］．迄今为止，人们对微重力诱导心脏重构的机制知之甚少。必威2490研究报告称，在小鼠长期暴露于模拟微重力(s-微重力)环境中，与心脏重塑有关的利亚罗定2型磷酸化水平增加，因此表明钙稳态异常也可能与此有关[12］．此外，即使细胞靶点和以下事件仍不清楚，微重力诱导新生大鼠心肌细胞内质网应激状态。在这种情况下，心肌细胞显示出线粒体蛋白的上调，以保存能量生产和促进存活。这种代谢适应减少了蛋白质的转译，并有助于心脏萎缩的发展[13］．细胞内钙^{2 +}心肌细胞的内稳态似乎在太空飞行和长时间卧床休息期间受到影响。事实上,细胞内钙^{2 +}机械卸荷后大鼠心肌细胞的肌浆网钙含量和膜片钳测量结果显示，肌浆网钙含量下降^{2 +}钙含量和钙含量的变化^{2 +}在Ca发布^{2 +}全身的Ca^{2 +}发布过程。此外，肌浆网间室的减少被钙的大量流入完全抵消^{2 +}通过l型钙通道[14］．硬币的另一面是，越来越多的证据表明，在真实或模拟的微重力条件下，微重力可以影响线粒体功能和原氧化条件。在许多模型中，显示了活性氧(ROS)水平或氧化反应产物检测的增加，这表明在暴露于微重力条件下的环境中，氧化物质增加[15- - - - - -18］．来自Cosmos 1887实验的研究强调了暴露于微重力12.5天的大鼠心脏组织的形态学变化。不仅在肌原纤维中，而且在线粒体水平上也观察到结构变化，其体积减少并破裂[19］．小鼠的后肢卸载，模拟长期暴露于微重力下(21天)，显示心肌组织中还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的比例发生变化。暴露后，心肌组织中谷胱甘肽含量降低，而其氧化形态增加，表明活性氧产生增加。有趣的是，在同一项研究中，晚期观察时间点(后肢卸载21天后长达9个月)的结果表明，心脏已基本恢复[20.］．

即使有大量证据表明改变钙的存在^{2 +}体内稳态和代谢状态与氧化失衡的报道，没有直接证据表明细胞内钙可能相互作用必威2490^{2 +}以及暴露于微重力下的心肌细胞中ROS的过量产生。

基于这些考虑，本研究的目的是在心肌细胞样模型中研究s微重力诱导的形态学和代谢改变之间的联系，并特别关注活性氧产生和细胞内钙之间的相关性。

在本研究中，我们使用随机位置机(RPM)模拟微重力条件下，以H9C2细胞系作为心肌细胞样模型。实验计划主要达到以下目的:(1)验证微重力对细胞形态、细胞骨架结构以及细胞活力、增殖和周期的影响;(2)分析细胞代谢状态，主要监测细胞内Ca^{2 +}水平与线粒体功能;(3)尝试保护策略来抵消微重力引起的影响。

2.材料和方法

2.1.设备和电池曝光参数

微重力条件模拟使用商用RPM通过标准电缆连接到控制台(RPM ver)。2.0，荷兰空间，莱顿，荷兰)。该装置的主要特性已在前面描述过[21- - - - - -23]和制造商手册中报告的使用参数。该装置主要是由两个独立的旋转框架组成的3D倾斜器，其中一个置于另一个内部，从而对安装在中间的生物样本施加定向净变化。该装置是一个基于“重力矢量平均”原理的微型重量模拟器。我们使用的桌面RPM被放置在培养箱中(以保持37°C的温度和CO₂和湿度水平)，并设置为3D随机模式，在样品展示期间，内帧和外帧的平均角速度为±60°/s [23］．选择在RPM上暴露于s微重力下的时间分别为6、12、24、48、72和96小时。考虑到H9C2细胞增殖和周期计时，以跟踪持久的生物事件，这些被确定。初步实验测试了活细胞培养条件和实验重复性。

2.2.化学品和材料

除非另有说明，细胞培养塑料制品来自Becton Dickinson Falcon (Steroglass s.r.l.， San Martino in Campo, Italy);细胞培养基、血清和抗生素购自赛默飞世尔科学公司(蒙扎，意大利);试剂和标准品来自Sigma-Aldrich(米兰，意大利)。

2.3.细胞培养

H9C2细胞系，来源于胚胎BD1X大鼠心脏(CRL 1446;American Type Culture collection)，在37°C, 5% CO下生长₂杜尔贝科改良Eagle培养基中含有(mM) 2谷氨酰胺，18碳酸氢钠，25葡萄糖，1丙酮酸钠，100单位/ml青霉素和0.1 ng/ml链霉素，并添加10%热灭活胎牛血清。在选定的实验中，用1mm n -乙酰半胱氨酸(NAC)作为抗氧化剂处理细胞。NAC浓度来源于先前发表的数据[22，24];此外，在使用NAC作为抗氧化剂之前，我们在H9C2细胞上进行了测试，以排除其可能的毒性。细胞播种24小时后，在同一培养箱中以1 g或s微重力RPM条件下培养达96小时。对于Ca的测量^{2 +}， ROS和O₂^⋅−H9C2细胞被镀于特殊的96孔板(cat。CLS3615 Corning Costar，米兰，意大利)。为了进行台虫蓝排除试验、细胞荧光分析、Western blots、葡萄糖和乳酸水平分析，细胞被镀在35毫米的培养皿中。免疫荧光染色，细胞被镀在固定在培养皿或μ-Dish 35毫米IBIDI成像盘(IBIDI GmbH, Martinsried，德国)。所有细胞培养支架(微板、培养皿等)均完全充满培养基，置于1g或RPM培养条件下，以避免气泡并尽量减少液体流动;因此，旋转过程中浮力和剪应力的影响可以忽略不计。

2.4.活力和增殖测定

台盼蓝排除试验通过台盼蓝染料溶液(0.5%的磷酸盐缓冲盐水(PBS))对细胞进行染色，并使用Bürker室计数染色细胞。蓝色染色的细胞被认为是不能存活的。

2.5.流式细胞术分析

根据已发表的协议进行细胞周期调查[25］．对照或s微重力暴露的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶/EDTA收获，离心(500xg, 5分钟)。细胞微球用70% ( ）乙醇和碘化丙啶溶液染色(50μg/mL碘化丙啶和100μg/mL PBS中的RNAse, Sigma-Aldrich)。使用FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)记录荧光强度。样品在三次重复中培养，每个颗粒至少获得10000个事件。使用FlowJo软件v8.8.6 (TreeStar, Ashland, OR, USA)计算细胞周期中处于G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比以及凋亡和坏死的细胞数量。

2.6.免疫荧光染色

4℃PBS中4%多聚甲醛固定10 min, 0.1%Triton X-100在PBS中透性10 min，室温下用阻塞液(10%山羊血清在PBS中)洗涤处理1 h。细胞与小鼠抗的初代抗体孵育β微管蛋白(在含有10%山羊血清的PBS中1:50稀释，赛默飞世尔科技，蒙扎，意大利)在4℃下过夜，然后与二抗(山羊抗小鼠AlexaFluor-488, 1:200稀释，赛默飞世尔科技)在RT中孵育1小时。洗涤后，用Alexa Fluor 546 Phalloidin(1:50稀释，Thermo Fisher Scientific)在RT下染色1小时，细胞核用DAPI (10μM, Thermo Fisher Scientific)在37°C下加热10分钟。对于线粒体形态，细胞如上面报道的那样被渗透、固定和阻塞，并与兔抗tom -20的一抗抗体(在含有10%山羊血清的PBS中1:10 0稀释，Thermo Fisher Scientific)在4℃下孵育一夜。用山羊抗兔AlexaFluor-488(1∶200稀释，Thermo Fisher Scientific)在RT下孵育1 h后显示初抗，用DAPI (10μM, Thermo Fisher Scientific)在37°C下加热10分钟。对于每个样本，从3个独立实验的5个不同随机选择的区域获取图像，使用蔡司LSM800 URGB共聚焦显微镜，配有直立AxioObserver Z1显微镜和40X N.A. 1.3油浸物镜和ZEN Blue 2.1软件(卡尔蔡司，Jena, D)。Z扫描获取的分辨率为 像素，每0.420获取一次焦平面μM作为细胞附着侧的起点玻璃，作为终点，细胞从采集场消失的平面。

2.7.免疫荧光染色的定量分析

2.7.1.细胞高度

利用ZEN Blue 2.1软件离线计算细胞高度，并从Z-stack图像采集中获得正交投影(XZ)的三维重建。对于每个单个细胞，测量跟踪细胞粘附平面和细胞体最高点之间的距离，通常在核区域附近。

2.7.2.细胞骨架结构与线粒体网络

使用ImageJ的斐济分布(ver1.52 2p)离线分析共聚焦荧光图像[26］．为了测量细胞骨架组织，利用“make binary”和“骨架化”函数对来自赤道面的光学切片进行处理，以获得简化的形态学模型。对处理后的图像，利用“分析骨架(2D/3D)”函数计算平均值β细胞内微管蛋白或肌动蛋白丝长度(以任意单位表示)。

利用Valente及其同事开发的ImageJ宏工具MiNA对来自赤道面的光学切片进行了线粒体网络形态分析[27］．在1g或s微重力下的样本中，“个体”(定义为图像中不包含连接像素的物体的数量，它决定了标点或杆状线粒体的数量)，“单个细胞中的分支结构”(勾勒出图像中包含至少一个连接像素的物体的数量，因此由多个分支组成，它定义了细胞内线粒体网络的数量)，测量“单细胞平均分枝长度”(单细胞所有枝条/分枝的平均长度)。

2.8.西方墨点法

将细胞刮取并收集在样品裂解缓冲液(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10%甘油，0.1 M二硫苏糖醇，0.002%溴酚蓝)中。使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad DC;Bio-Rad实验室，米兰，意大利)。细胞提取物在7.5%或10% ( ）均质平板凝胶(40μg of protein/lane)，然后转移到硝化纤维素膜(突起;Whatman-GE医疗保健，米兰，意大利)。膜与小鼠单克隆抗杂交β微管蛋白抗体(1:500稀释，赛默飞世尔科学公司)或小鼠单克隆抗体β肌动蛋白抗体(1:10 000稀释，圣克鲁斯生物技术公司，海德堡，德国)，然后与辣根过氧化物酶偶联抗小鼠或抗兔igg孵育(1:10 000稀释，通用电气保健公司，科隆-蒙泽塞，意大利)。使用化学发光试剂盒(Pierce EuroClone S.p.A, Pero, Italy)检测相关蛋白，并使用图像采集系统(Uvitec mod Alliance 9.7, Uvitec, Cambridge, UK)获取信号并进行分析。小鼠单克隆抗gapdh抗体(1:10 000稀释，Merck S.p.A, Vimodrone, Italy)作为负载对照。

2.9.细胞培养基中葡萄糖和乳酸水平的测定

使用Free Style Optium血糖计(Abbot Laboratories, Rome, Italy)和乳酸Pro分析仪(Arkray Inc.)检测生长培养基中的葡萄糖和乳酸水平。日本京都),分别。

2.10.活细胞中的荧光测量

细胞与正常的外部溶液(NES in mM: 140 NaCl, 2.8 KCl, 2 mM CaCl)孵育₂2 MgCl₂， 10个葡萄糖和10个HEPES, pH 7.3)包含表中报道的一种探针1(Thermo Fisher Scientific)在37°C下加热40分钟。冲洗后，使用microplate reader (Synergy H1 multimode, Biotek, Bad Friedrichshall, Germany)在25°C下获取荧光信号，并使用GEN5软件存储在计算机上。(Biotek,坏)。

根据所使用的特定探针设置激励和发射滤波器1)．荧光值的荧光-4-，H₂- dcfda -，或MitoSox red - loading cells表示为的平均值(平均值的±标准误差(SEM))/手机号,在哪里是获取的荧光值，并归一化为孔中的细胞数量。负载jc1细胞的荧光值表示为红/绿荧光比的均值(±SEM)，该比值取决于线粒体膜电位[28］．对于每个实验条件，在三个独立的实验中进行8次重复。

2.11.细胞氧化状态和损伤

2.11.1.总抗氧化状态

采用6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸(Trolox-)等效抗氧化能力(TEAC)法检测细胞群的总抗氧化状态。细胞在冷缓冲液(5mm磷酸钾，pH 7.4, 0.9% NaCl, 0.1%葡萄糖)中超声，并在10000 xg下在4℃下离心15分钟，按照制造商(美国密歇根州安娜堡开曼化学公司)的描述进行分析。简单地说,10μ使用Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad Laboratories Srl)测定含有等量细胞质蛋白的每个样品的L，重复添加三次至10次μL的肌红蛋白和150μL制造商提供的显色剂溶液。反应是由40的加入引起的μL H₂O₂．RT孵育3分钟后，使用microplate reader (Synergy H1 multimode, Biotek)在750 nm下读取反应混合物。参考先前报道的纯含Trolox反应(范围0-0.33 mM)计算的线性校准曲线，将结果表示为Trolox当量[28］．

2.11.2.蛋白质羰基测量

蛋白质羰基含量是蛋白质氧化的标志，使用蛋白质羰基测定试剂盒(开曼化学)进行测定。简单地说，用PBS冲洗细胞，在含有50 mM MES (pH 6.7)和1 mM EDTA的10体积缓冲溶液中超声，然后进行如下处理。离心(10,000xg, 4℃，15分钟)后，200μ将细胞质组分L加入800μL的2,4-二硝基苯肼(DNPH)或2.5 M盐酸(空白对照)，在室温下在黑暗中孵育1小时。加入1 mL 20%三氯乙酸(TCA)并在冰上孵育5分钟后，样品和坯料离心(10,000xg，在4℃下孵育10分钟)，得到的球粒重新悬浮在1 mL 10% TCA中并重新离心(10,000xg，在4℃下孵育10分钟)。这一步骤重复三次，使用1ml乙醇:乙酸乙酯混合物(1:1)重新悬浮小球。最后的蛋白球重悬于500 mL盐酸胍中，离心(10000 xg, 4℃下10分钟)。羰基含量的测定基于上清液在370 nm处的吸光度，DNPH的摩尔吸附系数为22,000 M⁻¹厘米⁻¹．如前所述，结果以每毫克蛋白质的纳米摩尔DNPH表示[28］．

2.11.3.丙二醛测定

丙二醛(MDA)形式，脂质过氧化的标记物，按照制造商的说明使用OXItek TBARS检测试剂盒(ZeptoMetrix公司，Buffalo, NY, USA)进行分析。简单地说,100年μL的SDS与100混合μL超声细胞样品(PBS)， 2.5 mL硫代巴比妥酸缓冲试剂。然后在95°C下孵育1 h，在冰浴中冷却10 min停止反应。离心(3000 rpm, 15 min)后，在532 nm处读取上清吸光度。参照标准曲线计算丙二醛含量。如前所述，结果以每毫克蛋白质的丙二醛纳米摩尔表示[28］．

2.12.统计分析

实验值表示为 ．统计显著性评估使用学生 -使用Prism5软件(GraphPad, San Diego, CA, USA)进行测试。< 0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1.细胞形态，细胞骨架结构和线粒体网络

H9C2细胞在标准(1 g, CTR)或s微重力(RPM, RPM)条件下粘附生长达96小时，以模拟长期暴露。在选定的时间(24、48、72和96小时)，对细胞形态进行分析。数据1而且2从染色的细胞样本中收集有代表性的图像和定量分析，分别描述细胞骨架组织(肌动蛋白和微管蛋白)和线粒体网络。定量分析由共聚焦显微镜获得的单张光学切片图像(从三个独立实验的每个样品获得5张图像)，并使用ImageJ软件应用程序分析，以量化在Phalloidin和anti-染色的样品中存在的单细胞肌动蛋白或微管蛋白丝的平均长度β微管蛋白(图1(一))，并在用TOM20染色的样品中评估单细胞线粒体网络(图2(一个))[27］．观察单个光学切片的图像集合，暴露细胞和未暴露细胞之间没有显著差异(图1(一)而且2(一个))，除了细胞骨架结构的轻微变化(图1(一))．定量分析表明，s微重力调节了肌动蛋白丝的平均长度，其影响在暴露96 h时变得具有统计学意义，而微管蛋白在任何测试条件下均无显著变化(数据未显示)(图)1 (c))．此外，获取z -堆栈图像并进行正交(XZ)重建，以允许细胞高度的量化(图1 (b)而且1 (d))．数据如图所示1 (d)显示s微重力对暴露24和48小时的细胞高度有很大影响(图1 (d))．细胞骨架主要成分的表达水平(β微管蛋白和β肌动蛋白)在任何测试条件下都没有显著的改变(图1 (e))．

关于线粒体网络的量化，考虑了以下参数:个体、分支结构和分支长度(图2 (b))[27］．数据显示，s-微重力暴露会影响线粒体在48小时和96小时的分支复杂性2 (b))．

3.2.细胞增殖与细胞周期

在s微重力照射期间，与对照细胞相比，H9C2细胞在48小时内增殖速度较慢，随后恢复正常生长进程(图3(一个))．因此，与对照组相比，暴露24小时后，细胞群显示细胞周期s期的细胞百分比增加，在暴露96小时后恢复正态分布(图3 (b)而且3 (c))．台盼蓝排除试验和细胞荧光分析也显示，对照组和暴露细胞均未明显检测到坏死或凋亡细胞。

3.3.细胞代谢状态

通过测量细胞活性的一些特征，绘制出H9C2细胞代谢状态的图像。暴露于微重力环境后，细胞内钙含量显著增加^{2 +}(图4(一))和伴随细胞内ROS的增加(图4 (b))和线粒体O₂^⋅−(图4 (c)）;这些增加可能导致在暴露过程中观察到的不同程度的线粒体膜电位的变化4 (d))与对照细胞比较。暴露的H9C2细胞代谢活性的变化也通过测量细胞培养基中的葡萄糖和乳酸水平间接证实。在所有测试中，这两种分子都导致暴露于s微重力环境中的细胞在培养基中的含量增加4 (e)而且4 (f))．这些结果证明，与对照细胞相比，暴露细胞中葡萄糖的消耗减少，乳酸的产生增加。

3.4.早期暴露于微重力环境

最显著的结果表明，s微重力诱导的效应开始于24小时暴露时间，因此进一步早的时间进行了测试。分别在暴露6 h和12 h后检测其主要形态和代谢特征。与相应的对照相比，暴露在12小时的细胞中肌动蛋白丝的长度更大，暴露在6小时的细胞中平均高度更低，暴露在6小时的细胞中线粒体网络受到影响(图5(一个)- - - - - -5 (c))．细胞内钙的^{2 +}细胞暴露6小时和12小时后，细胞内ROS水平没有出现变化，而从暴露6小时开始，细胞内ROS水平升高(图5 (d)而且5 (e))．O₂^⋅−暴露在6 h和12 h的细胞与相应的对照之间，线粒体膜电位水平和线粒体膜电位无显著差异(图5 (f)而且5 (g))．在培养基中葡萄糖和乳酸含量方面，前者在微重力下暴露12 h后含量较高;与对照组相比，暴露细胞的后者没有变化(图5 (h)而且5(我))．

3.5.对抗微重力效应的策略

上述结果表明，在早期6小时的暴露后，s微重力影响的第一个代谢标志是细胞内ROS水平的升高。这表明氧化代谢不平衡的存在。以抵消这种影响，并验证这是否是运转movens在较长时间的暴露下观察到的影响中，H9C2暴露在s微重力下，在1 mM n -乙酰半胱氨酸(NAC)，一种抗氧化剂存在下RPM。如预期的那样，NAC的存在从6小时暴露时间开始恢复了ROS水平，细胞内Ca^{2 +}和O₂^⋅−暴露24小时时的水平(图6(一)- - - - - -6 (c))．

抗氧化剂完全或至少部分地阻止了微重力对细胞形状和线粒体网络的影响6 (d)，6 (e),6 (f))以及培养基中的葡萄糖和乳酸含量(见图)6 (g)而且6 (h))．有趣的是，NAC的存在成功地恢复了暴露的H9C2细胞的增殖率(图6(我))．

为了评估长时间暴露在s-微重力下对细胞氧化平衡和氧化损伤标记物存在的整体影响，我们测定了总抗氧化状态(用Trolox等效抗氧化能力(TEAC)测试)、蛋白质羰基含量和硫代巴比妥酸反应物质(tbar)。在所有被测样品中，TEAC均未发生改变7(一))．s-微重力暴露诱导的ROS增加，分别引发了蛋白质羰基含量和蛋白质氧化和脂质过氧化标记物tbar的显著增加(图7 (b)而且7 (c))．特别是，暴露细胞中蛋白质羰基含量的增加在48小时和72小时后变得具有统计学意义，而在96小时后，暴露细胞和对照细胞之间没有任何差异(图7 (b))．与对照细胞相比，暴露24 h后，细胞的脂质过氧化明显增加7 (c))．NAC的存在也阻止了这些影响(图7 (b)而且7 (c))．

4.讨论

大量的实验证据指出，单细胞对重力的变化有反应，这种反应可能对太空飞行中器官层面的生理改变起着至关重要的作用。太空飞行期间的微重力环境或暴露在国际空间站上的失重环境是心血管变化的潜在来源。即使报道了大量心血管改变的证据，如室性心律失常风险增加和心肌质量和功能减少，但对细胞水平上的改变所知甚少[必威249029- - - - - -31］．

在本研究中，我们研究了微重力在心肌细胞样细胞的细胞水平上的影响，寻找其形态、细胞骨架和代谢的潜在变化。

为此，我们使用了RPM，这是一种台式微重力模拟器，以前也用于暴露其他细胞表型[22，23，32]，并被广泛接受为有关细胞暴露于失重环境的地面研究的有效工具[33，34］．通常，由于RPM的功能模式原理，它被用于研究微重力对缓慢过程的影响(在小时的时间尺度上)，并分析可能的有害影响或适应过程[34］．因此，使用这个微重力模拟器，不可能揭示由s微重力引起的秒或分钟量级的早期变化。

在H9C2心肌细胞中，s-微重力暴露后，我们没有观察到微管或肌动蛋白组织的显著质的差异。定量分析显示，暴露时间在12 h早期和96 h晚期时，肌动蛋白丝的平均长度显著增加。然而，如果考虑到细胞骨架蛋白的表达水平在暴露后没有改变，这表明整体微管和微丝似乎保留了它们的整体组织。

关于微重力对细胞骨架的影响，发表了许多明显相互矛盾的结果，这些结果可能与细胞表型、暴露时间和真实或模拟微重力有关。Vorselen及其同事回顾了重力变化对细胞骨架影响的研究结果[35］．他们的结论是，即使在哺乳动物细胞中不同的程度和不同的特征，细胞骨架也可以被认为是触发细胞内反应的初始重力传感器[35］．

事实上，在暴露于真正微重力(神舟六号任务)的原代心肌细胞中，发射后4小时就出现了微管组装的改变，而微丝(肌动蛋白)的分布和组织没有出现显著变化[36］．同样的心肌细胞表型暴露于地面模拟倾斜旋转微重力下，微丝和微管分布紊乱，无明显解聚[37］．其他作者也提出，细胞骨架的不同独特行为可能是由于真实和模拟微重力之间的不同条件以及不同的暴露时间[36，38］．在我们的模型中，暴露在12 h早期和96 h晚期时观察到的肌动蛋白丝平均长度的增加表明了s微重力敏感肌动蛋白网络，表明了肌动蛋白微丝的动态响应，可能导致细胞高度在早期(暴露6 h后高度降低)和后期(暴露24和48次后高度增加)的短暂变化。暴露于rpm产生的s微重力后，在其他细胞表型中也观察到类似的动态行为，如TCam-2精原细胞瘤细胞和MC3T3-E1成骨细胞样细胞[22，32］．我们和其他发表的关于细胞骨架成分在微重力环境下的结构修饰的研究结果再次表明，这是一种细胞类型特异性的反应，至少可以部分地通过不同的细胞骨架动力学和肌动蛋白结构和微管组织的调控来解释[39- - - - - -42］．众所周知，外部环境对细胞骨架结构的影响在影响细胞功能方面非常重要[43］．细胞骨架由不同的成分组成:微管蛋白构成的微管，肌动蛋白的微丝和中间丝。许多作者提出了细胞骨架网络的功能作用，这是公认的，如调节细胞生物学特征，如形态、运动、有丝分裂、细胞内细胞器分隔化，从而代谢[44- - - - - -46］．在细胞骨架支架上产生的细胞外力在影响增殖和细胞周期方面起着关键作用[47］．在我们的实验条件下，从细胞暴露后的第一个24小时开始，我们观察到细胞周期s期细胞增殖率和细胞积累的降低;即使在较长的暴露时间，细胞似乎挽救了正常的复制速率，这表明在H9C2细胞中，s微重力诱导的效应是短暂的。微重力诱导的细胞增殖减少也出现在其他细胞表型中[22，32，48，49］．然而，关于微重力对干细胞和从多能干细胞分化出来的心肌细胞生长的影响存在争议[必威249050- - - - - -54］．这些引入了一个假设，即微重力诱导的效应不仅依赖于表型，而且依赖于被测细胞的功能和代谢状态。

在我们的H9C2心肌细胞中，微重力也引起代谢变化。确实，微重力暴露影响线粒体排列，细胞内Ca^{2 +}水平和细胞氧化状态。特别是微重力作用下钙含量的增加^{2 +}活性氧(包括由线粒体产生的物种)水平与可能增加的厌氧活动(更低的葡萄糖摄取和更高的乳酸生产)相补充，并持续长达96小时的长期暴露。据报道，在心肌细胞中，微重力暴露导致的线粒体功能障碍和ROS产生，如果不能适当预防，可能在引导导致心脏心律失常的修饰方面发挥关键作用，正如在一些宇航员身上观察到的那样[55］．

在我们的研究中，在早期暴露时间(6-12小时)，s微重力影响的特征是ROS产生、肌动蛋白和线粒体网络排列以及葡萄糖摄取。

事实上，暴露于微重力(6小时后)引起的第一个变化与ROS失衡有关，而细胞内Ca^{2 +}之后(从暴露24小时后开始)似乎被修改了。微重力诱导的作用时间提示早期ROS增加和细胞骨架改变是“机械化学转导”的主要角色。此外，活性氧增加影响l型钙通道和利yanodine受体的蛋白质[56];因此，我们可以假设这可能是触发细胞内Ca的事件^{2 +}上升。

有趣的是，细胞高度和肌动蛋白丝长度在暴露于s微重力的早期迅速改变。有大量证据表明，机械负荷在细胞骨架的重排中起着关键作用，进而影响细胞的生长、代谢和分化[57- - - - - -59］．这些证据支持了以下假设:在H9C2心肌细胞中，s微重力通过改变外力分布，通过细胞骨架机械转导机制和ROS产生触发细胞反应。有趣的是，使用抗氧化剂NAC几乎完全阻止了s微重力暴露在早期和晚期引起的影响。在其他细胞模型中也观察到类似的结果[22，32，60］．

从我们的结果中可以明显看出，在s微重力环境下，培养基中抗氧化剂NAC的存在消除了其对细胞周期进程的影响，从而将这些改变与氧化剂的产生联系起来。即使细胞生理学中ROS的产生是代谢稳态的正常部分，氧化应激和损伤也可能是自由基产生和清除之间生理平衡的细胞失调的结果。在重力降低的情况下进行太空旅行和居住需要采取能够防止这些变化的对策。在这种情况下，一些抗氧化策略似乎是有效的。在2017年飞往国际空间站的一项实验中，纳米细菌被用来中和肌肉细胞中的氧化应激[61］．

在本研究中，我们观察到s-微重力深度影响H9C2细胞的代谢状态，增加细胞外基质中的乳酸水平。这可能是由于ROS不平衡直接改变了线粒体活性。事实上，作为ROS清除剂的抗氧化剂NAC处理逆转了这一效果，避免了ROS对H9C2细胞的损伤。这些结果与在宇航员身上观察到的有氧能力下降是一致的[62]，这可能是由于缺乏对ROS过量生产的控制，尽管分子机制仍未完全了解。

我们观察到，不仅ROS的产生增加，细胞外乳酸分泌也增加，葡萄糖的使用也减少，这反过来表明细胞代谢状态的变化。值得注意的是，在我们的类心脏细胞中，暴露于s微重力显著影响细胞的能量能力以及耗氧与氧化磷酸化的耦合能力。这与在C2C12细胞等肌肉模型中获得的其他结果一致[63]以及在骨模型中，代谢组学和蛋白质组学分析显示糖酵解增加，而克雷布斯循环在s微重力暴露后琥珀酸-富马酸转化时被阻断[64］．虽然还需要找到模拟微重力和代谢效应之间的关联的所有拼图，但肯定的是，过量的ROS和线粒体功能似乎是有希望的关键候选因素。这些结果加上在其他模型中获得的数据，提高了对微重力对细胞氧化状态影响的认识，并提出了一种可能的抗氧化保护策略。

虽然还需要进一步的实验和试验，但本研究中观察到的NAC对早期ROS升高的解毒作用，为宇航员在执行太空任务之前规划饮食提供了可能的对策。

5.结论

RPM和H9C2心肌细胞的使用使得描述暴露于s微重力所引发的影响成为可能，并假设其作用机制。与地球重力下生长的细胞相比，s微重力暴露的H9C2细胞增殖速度较慢，代谢活性较低。的确，在RPM暴露后，H9C2细胞显示细胞骨架和线粒体网络重排，细胞内ROS水平增加^{2 +}］_我还有线粒体超氧阴离子。氧化剂种类增加后，蛋白质羰基的形成。在概览中(图8)，我们的数据表明，在心肌细胞样模型中，微重力早期影响了作为机械传感器的细胞骨架，并伴随细胞内ROS水平的增加。氧化平衡的改变反过来可能驱动所有其他观察到的影响，导致细胞代谢的改变，从而降低增殖速率和蛋白质羰基的形成，这意味着参与兴奋-收缩机制的蛋白质的功能效率可能发生了改变。有趣的是，NAC的存在及其抗氧化能力逆转了微重力引起的影响。

这些数据表明，适当的抗氧化补充剂也可以防止微重力条件下人类永久状态引起的心功能障碍。

数据可用性

所有数据均可按需提供。

信息披露

在2017年10月2-6日于法国胡安勒平举行的ISPS-7和ELGRA-25国际会议上，本手稿中的一些数据作为初步结果提交。

的利益冲突

作者声明本论文的发表不存在任何利益冲突。

作者的贡献

Simone Guarnieri和Caterina Morabito同样对这项研究做出了贡献。

致谢

这项工作得到了意大利航天局(ASI no.)的支持。2014 - 018 r)。

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