羟氯喹增强PPAR诱导的细胞凋亡α786-O透明细胞肾细胞癌的拮抗剂与抑制自噬相关

摘要

透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌的主要病理类型。由于某些基因突变，ccRCC细胞表现出一定程度的固有耐药性。近年来，过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPARα)拮抗剂是一种靶向治疗药物，能够诱导ccRCC细胞系的凋亡和细胞周期阻滞。真核细胞的自噬在肿瘤细胞的增殖、生存和死亡中起着复杂的作用，应激可诱导自噬。在我们的研究中，我们发现PPAR的表达α在高分化ccRCC组织和786-O细胞系中低，而在低分化ccRCC组织中高。PPAR的水平α在ccRCC组织中的表达与分化程度相关，而与ccRCC患者的性别和年龄无关。研究结果还表明，PPARαGW6471拮抗剂可降低786-O ccRCC细胞系细胞活力，诱导细胞自噬。羟氯喹可抑制这种自噬。羟氯喹与GW6471联合作用时，786-O细胞的活力较GW6471和羟氯喹单独作用时进一步下降，并促进细胞凋亡。与此同时，羟氯喹和GW6471共同作用于人肾2细胞时，细胞活力仅受轻微影响。因此，我们的研究结果表明，GW6471与羟氯喹联合使用可能是一种新的、潜在有效的ccRCC治疗方法。此外，这种方法可能是安全的，因为它对正常肾组织的影响最小。

1.简介

肾细胞癌是一种来源于正常肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，透明细胞肾细胞癌(clear cell Renal cell carcinoma, ccRCC)是其主要病理类型[1］．根据流行病学调查，肾细胞癌的发病率在泌尿系统各种肿瘤中排名第二[2］．约1/3发生转移必威2490^{理查德·道金斯}初步诊断为肾细胞癌的患者[3.］．由于基因突变的存在，肾细胞癌可抵抗传统化疗药物和放疗[4］．抗血管生成和酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼和索拉非尼，已开发并应用于临床研究[5，6］．不幸的是，近年来已有肾细胞癌对这些药物的耐药报道[7，8］．因此，开发新的靶向药物治疗肾细胞癌是非常必要的。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是类固醇激素受体超家族的一员，由三个主要亚型组成，即PPARα, PPARβ/δ，及PPARγ［9］．PPARα含有类视黄酮X受体(RXR)的异二聚体可以与过氧化物酶体增殖反应元件(PPRE)结合，并调节与脂质、葡萄糖、氨基酸代谢和炎症反应相关的几个基因的表达[10］．多年来，研究人员发现PPARα可能是治疗白血病、黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和胶质母细胞瘤的潜在靶点[11- - - - - -15］．关于ccRCC, Aboud等人报道PPARα拮抗剂GW6471可诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞[16］．PPARα可能是治疗肾细胞癌的潜在靶点之一。

自噬是一种细胞器或大分子蛋白质被“包裹”进自噬体的机制。分解的细胞器或大分子在溶酶体中产生小分子，供真核细胞循环利用[17］．自噬相关基因(ATGs)编码大多数自噬相关蛋白，用于自噬的初始化和自噬小体的形成。自噬通量是自噬的一个完整过程[18］．自噬基础水平可调节细胞增殖、生长和分化，实现细胞内稳态[19，20.］．当细胞处于应激状态时，如细胞周期停滞、能量不足和生长抑制时，自噬水平会增强，从而使细胞能够适应改变后的条件，避免死亡或其他不良结果[21，22］．自噬在肿瘤细胞生长和死亡中的作用尚不明确，但有研究人员认为，自噬通过增强细胞凋亡或诱导自噬细胞死亡具有保护作用，对肿瘤细胞的命运产生“双刃剑效应”[23］．

GW6471是否能诱导自噬尚不清楚;此外，其对ccRCC细胞命运的影响也是未知的。因此，在本研究中，我们试图发现GW6471是否能诱导786-O ccRCC细胞系发生自噬。此外，我们试图确定GW6471在786-O细胞中的作用。我们发现PPAR的表达α在高分化ccRCC组织和786-O细胞中表达低，而在低分化ccRCC组织中表达高。随后，我们发现GW6471可以降低786-O细胞的活力，诱导整体自噬。自噬抑制剂羟氯喹与GW6471共处理786-O细胞时，细胞活力明显低于GW6471单独处理或羟氯喹单独处理，细胞凋亡明显增加。此外，GW6471和羟氯喹共同作用于人肾2 (HK-2)细胞时，对细胞活力无明显影响。因此，羟氯喹和GW6471联合用药可能是一种新的、潜在的治疗ccRCC的有效策略。此外，这种方法可能是安全的，因为它对正常肾组织只有最小的影响。

2.材料与方法

2.1.细胞系和培养

786-O ccRCC细胞系和HK-2人正常肾小管上皮细胞系均来自中国科学院细胞库。两株细胞株在添加10%胎牛血清(Gibco, USA)和1%青霉素-链霉素(Gibco, USA)的Roswell Park Memorial Institute-1640培养基中培养(Gibco, USA)， 37℃，含5% CO的培养箱(Thermo, USA)中培养₂和饱和湿度。

2.2.药物

的PPARα拮抗剂GW6471和激动剂WY14643购自MCE(美国)，羟氯喹购自都莱生物(中国)。

2.3.免疫组化(IHC)染色

40例患者的ccRCC组织及邻近正常组织均采自东吴大学第三附属医院病理性科，工作人员及时对所有组织进行石蜡包埋。随后，所有样品在二甲苯中进行脱蜡，并在乙醇梯度(100%，95%和90%)中水合。然后将组织在乙二胺四乙酸(EDTA)中加热以提取抗原，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，每次洗涤3分钟。应用免疫组化染色试剂盒(Maxim，中国)进行兔抗人PPAR免疫组化染色α一抗多克隆抗体(Protech，美国，稀释比例为1:10 0)，按照制造商说明生产。组织在另一种乙醇梯度(85%，95%和100%)中脱水。细胞核用苏木精染色。用载玻片覆盖所有组织，使用荧光光学显微镜在光学模式下观察(Olympus IX77，日本)。用ImageJ(美国)软件测量免疫组化中光密度(OD)的半值。ccRCC组织分化程度由两名有经验的病理科人员独立分析。患者的年龄、性别特征见表1．采集和使用组织经东吴大学第三附属医院伦理委员会批准。

2.4.RNA提取与实时聚合酶链反应定量(qRT-PCR)

使用Total RNA-pure Kit (FORE GENE，中国)提取786-O和HK-2细胞的总RNA，并在无RNase-free的ddH中溶解₂O (FORE GENE，中国)按照制造商的说明。接下来，利用RT Easy™I Kit (FORE GENE，中国)将RNA样本用于生成cDNA。最后，利用Real-Time PCR Easy试剂盒(FORE GENE，中国)对cDNA样本进行qRT-PCR。扩增使用ABI7500(美国应用生物系统公司)。PPAR的引物α和GAPDH由Takara Biotechnology (Takara, China)合成，序列见表2．GAPDH作为内对照，PPAR的相对表达量α是由2^-ΔΔCT方法(24］．qRT-PCR的详细步骤见表3.．

2.5.细胞活力测定

786-O和HK-2细胞被植入( ）在96孔板中培养粘附。第二天，他们分别接受了6、12、24或48小时的不同组药物治疗。然后,10μ每孔加入L of Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂(Phygene, China)。孵育2小时后，吸光度( ）在450nm处用microplate reader (Thermo, USA)测量每口井的样品。活细胞百分比的计算公式如下:

2.6.吖啶橙染色

786-O细胞被植入( ）在24孔板中进行粘附用不同组的药物治疗24小时。染色前，每孔用PBS冲洗15分钟，三次，用4%聚福尔马林固定细胞10分钟。染料吖啶橙(AO) (Solarbio，中国，稀释至10μg/mL)加入每孔。15分钟后，每个孔再次用PBS洗15分钟，共洗三次。用荧光光学显微镜在荧光模式下对所有孔进行观察。AO染色细胞核呈绿色，溶酶体荧光呈橙色[25］．

2.6.1.流式细胞术测定细胞凋亡

处理后收集786-O细胞，用PBS洗涤两次。细胞凋亡测定采用Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双荧光染色试剂盒(Phygene, China)，按照制造商说明进行。使用FACS CantoII流式细胞仪(BD, USA)计算凋亡细胞的百分比。在流式细胞术图像中用十字将四个“门”隔开:存活细胞位于左下[Annexin V(-)和PI (-)];早期凋亡细胞位于右下[Annexin V(+)和PI (-)];晚期凋亡细胞位于右上方[Annexin V(+)和PI (+)];坏死细胞位于左上[Annexin V(-)和PI(+)]。

2.7.西方墨点法

收集的786-O细胞用药物处理24小时，并用PBS洗涤两次。根据制造商的说明，使用裂解缓冲试剂盒(KeyGEN，中国)在冰上测定细胞裂解。所有样品在4℃，12000 g/min离心5分钟。按照说明书使用蛋白质定量分析试剂盒(KeyGEN，中国)估计蛋白质浓度。 在所有蛋白质样品中加入缓冲液，加热至100°C 5分钟。蛋白质分别在8%、10%或15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离。随后，将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore, USA)，用溶解在Tris-buffered saline (TBST)中的5%脱脂牛奶阻塞膜1小时。阻断完成后，将膜与稀释的兔抗人原抗体TBST孵育过夜(ab克隆，中国，每个抗体的稀释:PPARα: 1: 2000年,LC3: 1: 1000 p62 / Sequestosome-1: 1: 1000年,PARP: 1: 1000年,Caspase-3: 1: 1000 GAPDH: 1: 4000)。第二天，用TBST清洗膜15分钟，3次，并用山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(ab克隆，中国，TBST稀释1:8 00)孵育1小时。与二抗孵育后，用TBST冲洗10分钟，共洗3次。最后，使用Enhanced Chemiluminescent Plus试剂(Millipore, USA)检测蛋白质信号，并用蛋白质成像系统(Tanon, China)进行可视化。用ImageJ软件测量了Western blotting中光密度的半值。

2.8.统计分析和图像捕获

每个实验至少独立进行三次。所有数值数据以 ．对数值数据进行分析，并用Prism 6 (USA)软件绘制图表。所有价值数据的比较都使用未配对的学生数据进行分析 -单因素方差分析采用Fisher最小显著性差异(LSD)检验，方差研究采用卡方检验。所有IHC和荧光图像均由Image-Pro-Insight(美国)软件捕获。 被认为是有统计学意义的差异。

3.结果

3.1.PPARα在高分化的ccRCC组织和786-O细胞系中低表达，而在低分化的ccRCC组织中高表达

在本研究的第一部分，PPAR的表达α在ccRCC组织和786-O细胞系中进行检测。如图所示1(一)而且1 (b)，行免疫组化检测PPAR的表达α在ccRCC组织中结果提示PPAR的表达α在高分化的ccRCC组织中的表达低于相邻的正常组织。然而,PPARα在低分化的ccRCC组织中高表达，与邻近正常组织表达相似。在786-O细胞系中，如图所示1 (c)- - - - - -1 (e)，我们观察PPAR的表达αqRT-PCR和Western blotting结果显示，与HK-2细胞相比，mRNA和蛋白含量较低。另一方面，我们研究了PPAR的相关性αccRCC在性别、年龄、分化程度等临床因素中的表达。在表4， PPAR的表达α与分化程度有关，而与患者的性别和年龄无关。

3.2.GW6471对786-O细胞活力的降低呈剂量依赖性而非时间依赖性，对HK-2细胞活力的降低无剂量依赖性或时间依赖性

接下来，我们进行了CCK-8试验，以检测GW6471处理的786-O细胞和HK-2细胞活力的变化。如图所示2(一个)GW6471处理的786-O细胞活力呈剂量依赖性(0 ~ 75μ米)的方式。此外，WY14643对786-O细胞在任何测试浓度(0-75μM).然而，Figure2 (b)表明当786-O细胞被25μM作用12 h后，细胞活力与6 h组相比无显著差异。另一方面，当786-O细胞被25μM作用24 h后，细胞活力较6 h和12 h组降低。然而，GW6471处理48h的786-O细胞的活力与处理24h的细胞相比没有显著差异。最后，如图所示2 (c)GW6471或WY14643在任何测试浓度(0-75μ米);数字2 (d)表明，当HK-2细胞处理25μM GW6471和WY14643作用6、12、24和48 h，对细胞活力也无显著影响。这些结果表明，GW6471可降低786-O细胞的活力，但呈剂量依赖性而非时间依赖性;而GW6471对HK-2细胞的活力无影响，但呈剂量依赖性或时间依赖性。

3.3.GW6471诱导786-O细胞整体自噬

GW6471可降低786-O细胞活力，诱导细胞周期阻滞和凋亡;因此，我们研究了GW6471是否能诱导786-O细胞自噬[16］．根据已有的关于GW6471治疗其他人类肿瘤的文献和我们自己必威2490的初步实验，我们选择了25个μM的GW6471和WY14643和50μ在本研究的其余实验中，使用M羟氯喹对细胞进行24小时的治疗[26］．羟氯喹(或氯喹，在一些自噬研究中被应用)是一种自噬阻断剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合[27］．我们首先用AO染色溶酶体，如图所示3(一个)而且3 (b)，发现GW6471处理组溶酶体归一化到每个细胞的荧光信号比未处理组和WY14643处理组更亮。GW6471加羟氯喹组的荧光信号明显强于GW6471和羟氯喹组。如图所示3 (c)而且3 (d)Western blot分析显示，GW6471组的LC3-II/LC3-I比值较未处理组和WY14643组升高，LC3-II/LC3-I被认为是自噬诱导的标志。GW6471加羟氯喹组LC3-II/LC3-I比值在各实验组中最高。p62 (sequestosomeon -1, SQSTM-1)是一种可用于监测自噬通量的蛋白，其在单独GW6471组中下降，而在羟氯喹组中升高，如图所示3 (e)而且3 (f)［27］．AO染色和Western blotting结果表明，GW6471诱导786-O细胞发生整体自噬。

3.4.GW6471与羟氯喹共处理后，786-O细胞活力进一步下降

自噬可以影响肿瘤细胞的命运;因此，我们探索抑制自噬是否会改变GW6471处理后786-O细胞的活力。如图所示4与GW6471单独羟氯喹和WY14643羟氯喹联合作用24小时相比，GW6471和羟氯喹联合作用对786-O细胞活力的影响更大。

3.5.羟氯喹与GW6471共处理可促进786-O细胞的凋亡比例

GW6471和羟氯喹联合处理的786-O细胞的活力低于GW6471和羟氯喹单独处理的细胞。我们研究了GW6471和羟氯喹联合作用下786-O细胞的死亡机制。进行流式细胞仪检测，结果如图所示5(一个)而且5 (b)， GW6471组的凋亡细胞比例均高于未处理组和WY14643加或不加羟氯喹组。当GW6471和羟氯喹共同作用于786-O细胞时，凋亡细胞的比例高于单独作用于GW6471的细胞。随后，我们进行western blotting，检测细胞凋亡的两个标志——cleaved- parp和cleaved- caspase-3。从图中推断5 (c)- - - - - -5 (e)在GW6471、羟氯喹和WY14643加羟氯喹组中，裂解PARP和裂解caspase-3的表达量均高于未处理组和WY14643加羟氯喹组。GW6471和羟氯喹联合处理786-O细胞时，各实验组中分裂PARP和分裂caspase-3表达量最高。结果如图所示5表明羟氯喹增强了GW6471处理的786-O细胞的凋亡。

3.6.GW6471与羟氯喹共处理HK-2细胞对细胞活力无明显影响

我们最终探索了GW6471联合羟氯喹是否会影响HK-2细胞的活力。如图所示6h -2细胞经羟氯喹处理24小时后，包括GW6471组在内的各实验组细胞活力均无显著影响。说明GW6471与羟氯喹共处理对HK-2细胞可能没有明显的细胞毒性作用。

4.讨论

PPARα可作为转录因子调节营养代谢。在肝细胞中，PPARα高表达，可调节肉碱棕榈酰转移酶1A和中链酰基辅酶A脱氢酶，从而增强脂肪酸β氧化(28］．在葡萄糖代谢中，PPARα带有RXR的异二聚体可以通过序列启动子与编码磷酸果糖激酶-1 (PFK-1)和丙酮酸激酶(PK)的基因结合，从而调节这两种酶的表达[29］．此外，在PPARα^-/-小鼠血浆中精氨酸积累，一氧化氮(NO)水平降低[30.]，这意味着PPARα可能影响氨基酸代谢。PPAR的表达α在过去对ccRCC细胞中在目前的研究中，我们的结果表明PPAR的表达α在高分化的ccRCC组织和786-O细胞系中表达较低，而在低分化的ccRCC组织中表达较高。ccRCC细胞的主要形态特征是细胞质中存在大量脂滴[31］．脂滴在ccRCC细胞中的积累与几个基因有关，包括肉碱棕榈酰转移酶1A (CPT1A)的低表达和脂肪酸合成酶(FASN)、周磷脂-3的过表达[32- - - - - -34］．此外，Du等报道了786-O细胞中脂滴的积累与CPT1A的低表达有关，而葡萄糖是786-O细胞中脂滴形成的主要成分[35］．然而，Wettersten等人报道CPT1A可能催化从游离脂肪酸合成酰基肉碱，在高级ccRCC中具有抗炎作用[36］．CPT1A基因可被PPAR调控α［37］．基于我们对PPAR的研究α在不同级别的ccRCC组织中表达，以及其他研究者之前的研究，可以说PPARα可能对不同级别ccRCC的增殖和生长具有复杂和可变的影响。最后，作为结果表4， PPAR的表达α与分化程度相关，而与患者的性别和年龄无关。PPARα可能是ccRCC组织分级的潜在标记物。未来，我们将收集更多的ccRCC组织样本，研究PPAR表达的相关性αccRCC和临床相关资料。

PPAR的作用α在不同肿瘤的治疗上也是复杂多变的。PPARα在黑色素瘤中低表达，非诺贝特(PPARα)可以通过下调AKT和ERK1/2磷酸化来抑制黑色素瘤的转移[38］．PPARα在副神经节瘤中高度表达。GW6471作用于副神经节瘤细胞株后，通过抑制PI3K/GSK3/促进细胞凋亡，抑制迁移β-catenin途径[26］．另一方面，PPARα与邻近的正常组织相比，在胰腺癌组织中过表达。然而，氯贝酸酯(另一种PPARα)可通过下调Wnt/诱导细胞凋亡，使细胞对辐射敏感β连环蛋白通路。在ccRCC细胞中，糖酵解是产生能量的主要途径。GW6471可通过下调癌基因c-Myc阻断糖酵解，诱导细胞周期阻滞[39］．在这项研究中，我们发现尽管PPARα与HK-2细胞相比，GW6471在786-O细胞中表达较低，前者细胞的活力可因剂量依赖性而非时间依赖性而降低。我们的结果与Aboud等人的结果相似。[16］．然而，我们发现WY14643对786-O细胞的活力没有显著影响。根据ccRCC的代谢情况，我们推测PPAR的低表达α可能是维持786-O细胞糖酵解基础水平的必要条件。WY14643对786-O细胞活力没有显著影响的原因还有待进一步研究。

在肾细胞癌中，基础水平的自噬在细胞生长和增殖中起着重要作用。Ma等应用免疫组化技术发现ATG9在ccRCC组织中的表达高于相邻正常组织，且这种表达升高是ccRCC预后的独立危险因素[40］．Lu等报道unc -51样激酶1 (ULK1, ATG1)是另一种自噬相关蛋白，ULK1高表达是ccRCC患者预后的独立危险因素[41］．当细胞处于应激状态时，可通过抑制pi3k /AKT/mTOR、MAPK/ERK/mTOR通路或激活AMPK/mTOR通路诱导细胞自噬[42- - - - - -44］．在Aboud等和我们的研究结果的基础上，我们进一步探讨了GW6471是否能诱导786-O细胞发生自噬。AO是一种荧光染料，可将酸性泡状细胞器染成红色，细胞核染成绿色[25］．羟氯喹是一种弱碱性药物，可轻微提高溶酶体的pH值，抑制自噬体-溶酶体融合，诱导高尔基体和内溶酶体系统发生自噬无关的严重紊乱，可能导致融合损伤[45］．当细胞内发生自噬且自噬通量通畅时，可在细胞内明显检测到AO信号。由于自噬通量被羟氯喹阻断，溶酶体和自噬体可在细胞中积累并观察到[46］．我们发现，当GW6471单独处理786-O细胞时，AO染色的溶酶体荧光信号比未处理组和WY14643组更亮。当GW6471与羟氯喹联合作用时，细胞的荧光信号明显比GW6471、单独羟氯喹和加羟氯喹组的WY14643荧光信号更亮、更丰富。这一观察结果证明，溶酶体在GW6471处理的786-O细胞中明显多于未处理组和WY14643组，并在羟氯喹处理的GW6471细胞中积累。LC3 (ATG8)是自噬体的标记物，包括LC3- i和LC3- ii两种类型。LC3-II是LC3-I的脂化型，由ATG4催化，被认为是成熟自噬体的标志[47］．p62 (Sequestosome 1/SQSTM1)是一种62 kDa的蛋白质，参与细胞生存、凋亡、炎症和自噬[48］．p62的两个结构域与自噬有关。UBA结构域可与泛素化蛋白结合，LIR结构域可与自噬体表面LC3相互作用。最后，当自噬通量流畅时，p62及其载物在自噬体中降解，与溶酶体融合[49，50］．然而，当自噬通量被阻断时，p62会在细胞内积累[51］．western blotting结果显示，GW6471组的LC3-II/LC3-I比值高于未处理组和WY14643组。GW6471加羟氯喹组LC3-II/LC3-I比值高于单独加羟氯喹组GW6471和加羟氯喹组WY14643。同时，p62在GW6471组中的表达低于其他各组，p62在羟氯喹组中在GW6471中积累。这些结果表明，GW6471可诱导786-O细胞发生整体自噬，羟氯喹可阻断细胞自噬。

自噬在肿瘤细胞中的作用尚不清楚。在肾细胞癌中，自噬对细胞命运具有双重作用[52］．舒尼替尼是酪氨酸激酶抑制剂的一线药物，在肾细胞癌的治疗中可阻断血管生成和抑制细胞增殖[53］．Li等发现该药可降低OS-RC-2肾细胞癌细胞系的细胞活力，并通过下调PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬。当OS-RC-2肾细胞癌细胞与舒尼替尼和氯喹联合治疗时，细胞活力的下降幅度大于舒尼替尼单独治疗时的下降幅度，这可能与促进细胞凋亡有关[54］．哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种营养和细胞生长的传感器，由mTOR1和mTOR2两个亚型组成。mTOR作为调控自噬的关键蛋白，通过“感知”PI3K/AKT、MAPK/ERK、AMPK上游信号的变化[55］．在肾细胞癌中，mTOR的表达高于正常肾组织，因此被认为是RCC治疗的靶点[56］．Zheng等报道mTOR双抑制剂AZD-2014可在786-O和OS-RC-2细胞中抑制细胞生长并诱导自噬。AZD-2014与氯喹联合作用后，细胞活力进一步降低，促进细胞凋亡[57］．这一发现提示AZD-2014与氯喹可能具有协同杀伤肾细胞癌细胞的作用。药物诱导的肾细胞癌自噬可增强细胞死亡。Ubenimex是一种氨基肽酶抑制剂，可增强免疫力，被认为是一种潜在的治疗肾细胞癌的药物[58］．Ubenimex可诱导786-O和OS-RC-2细胞发生自噬，当Ubenimex与mTOR抑制剂雷帕霉素共同作用时，细胞生长受到抑制。然而，当另一种自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)与ubenimex联合使用时，与单独使用ubenimex相比，细胞活力并无显著差异[59］．这一结果暗示了ubenimex增强的自噬通量与肾细胞癌的细胞死亡有关。索拉非尼是另一种血管生成和酪氨酸激酶抑制剂，也被用于治疗肾细胞癌[60］．该药物可通过下调肾细胞癌786-O和ACHN细胞的PI3K/AKT/mTOR通路抑制细胞生长，诱导细胞自噬。当细胞与3-MA和索拉非尼共同治疗时(或敲除ATG5基因)，索拉非尼的毒性作用被逆转，细胞活力高于单独索拉非尼治疗[61］．这表明索拉非尼诱导的自噬可促进肾细胞癌的细胞死亡。有趣的是，在我们的研究中，我们用流式细胞术检测了凋亡细胞的比例，结果显示，GW6471加羟氯喹组的凋亡细胞比例高于GW6471单独加羟氯喹组和WY14643加氯喹组。western blot结果显示，当GW6471和羟氯喹共同作用于786-O细胞时，分裂的PARP和分裂的caspase-3的表达量高于单独作用于GW6471或羟氯喹的细胞。可见，GW6471与羟氯喹联合使用可降低786-O细胞的活力，促进细胞凋亡。这说明抑制自噬可以增强GW6471处理的786-O细胞的凋亡。本段所讨论的结果总结为图中的示意图7．

虽然自噬在细胞死亡中的作用还不清楚，但一些研究人员已经从自噬体对细胞器的降解和自噬产生能量的角度解释了两者之间的关系。一些细胞器如线粒体、内质网和脂滴可被自噬体降解[62- - - - - -64］．Wang等报道了藤黄酸可诱导胰腺癌细胞凋亡和自噬。研究发现，活性氧(ROS)水平由于促进受损的线粒体而增加。观察到，胰细胞与藤黄酸和氯喹共处理后，细胞活力更大程度上降低，ROS水平升高，因为损伤线粒体的清除被抑制[65］．在肺细胞中，全氟烷基酸通过吞噬受损的内质网，避免内质网过度应激，降低细胞活力，诱导自噬[66］．另一方面，处于应激状态下的细胞可以通过自噬产生能量。前列腺癌是一种利用脂质产生能量的癌症[67］．雄激素消融可诱导雄激素敏感前列腺癌自噬，脂滴可通过自噬途径降解，释放游离甘油，为细胞产生能量[68］．当通过敲除ATG5基因阻断自噬时，前列腺癌细胞活力下降幅度高于雄激素消融组[69］．ccRCC细胞主要通过糖酵解利用葡萄糖产生能量。Aboud等研究发现，GW6471在786-O细胞中可通过下调c-Myc抑制糖酵解[39］．我们的研究结果表明，GW6471能增强细胞自噬，且与羟氯喹联合处理比单独处理更能降低细胞活力。因此，我们推测羟氯喹抑制了GW6471在786-O细胞中促进的自噬通量，自噬对葡萄糖的回收可能已经被抑制。GW6471和羟氯喹联合作用的786-O细胞葡萄糖含量不足以存活，ATP水平较单独GW6471组可能进一步降低，导致凋亡加剧[70］．

羟氯喹长期用于治疗疟疾和系统性红斑狼疮[71，72］．近年来，自噬在肿瘤治疗领域得到了研究，羟氯喹已在临床应用于治疗肿瘤，包括ccRCC [73］．根据我们的研究结果，GW6471与羟氯喹联合治疗对786-O肾细胞癌细胞有杀伤作用，但对HK-2细胞作用不大。与ccRCC组织的免疫组化结果和PPAR的表达相关α在786-O细胞系中，我们的研究结果表明羟氯喹和GW6471联合治疗高分化ccRCC可能是有益的，对正常肾组织的副作用最小。

我们发现羟氯喹和GW6471联合治疗可能是治疗ccRCC的潜在有效策略。然而，我们观察到PPARα在高分化的ccRCC组织和786-O细胞系中低表达，本研究将其作为细胞模型。因此，我们的研究结果可能只适用于治疗高度分化的ccRCC。但是，仅使用一个ccRCC细胞系进行分析是我们研究的局限性，因此我们打算使用更多的肾细胞癌细胞系如Caki-2或UM-RC-2来验证PPAR的作用α在不同病理模式的RCC中。

5.结论

我们的研究表明PPARα在高分化的ccRCC组织和786-O细胞中低表达，但在低分化的ccRCC组织中高表达。GW6471可诱导786-O细胞自噬，羟氯喹可阻断自噬。羟氯喹与GW6471联合使用对786-O细胞的杀伤效果优于单独使用GW6471或羟氯喹，这可能与促进细胞凋亡有关。此外，这种方法对HK-2细胞的活力几乎没有影响，因此在正常肾组织上是安全的。根据本研究结果，GW6471联合羟氯喹可能是一种新的、潜在的治疗高分化ccRCC的临床治疗方法。然而,进一步在活的有机体内需要进行研究和临床试验。此外，PPAR的原因α激动剂对786-O细胞增殖无明显影响，GW6471诱导786-O细胞自噬信号通路有待进一步探索。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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