预测肝细胞癌患者预后的ppar相关多基因标记的鉴定

摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)及其部分靶基因已被报道与肝细胞癌(HCC)的进展有关。HCC的预后不容乐观，需要更准确的预后指标。本研究的重点是从ppar相关基因集中发现潜在的预后标志物。从TCGA和GEO平台收集HCC的mRNA数据和临床信息。单变量Cox和lasso Cox回归分析用于筛选HCC预后基因。三个基因(MMP1，HMGCS2,SLC27A5)参与PPAR信号通路的蛋白被选为HCC的预后特征。根据所选基因的表达值和多变量Cox回归系数建立公式为: ．在TCGA HCC数据集中评估了三个基因标记的预后能力，并在三个GEO集(GSE14520、GSE36376和GSE76427)中进行了验证。结果表明，基于我们签名的风险评分是一个HR(风险比)为2.72 ( ， ）肝癌的存活率。该签名可能显著( ）区分预后差的肝癌高危和低危患者。此外，我们通过多变量Cox分析进一步探讨了特征与其他临床指标的独立性和适用性( ）和nomogram分析( )．以上结果表明MMP1，HMGCS2,SLC27一个从PPAR信号通路中筛选出5个可有效、独立、应用地预测HCC的预后。我们的研究为肝癌的预后提供了新的见解。

1.简介

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率在与癌症有关的死亡中排名第四[1］．必威2490约80%的原发性肝癌患者属于肝细胞癌(HCC)类别。肝癌是一种发展迅速且预后不良的疾病。目前，只有不到18%的HCC患者总生存期(OS)超过5年[2］．此外，由于HCC的异质性和缺乏有效的预后标志物，难以准确预测HCC患者的预后[3.，4］．因此迫切需要研究HCC的预后指标，以确保患者能得到更适当有效的治疗。

对于许多癌症类型，特异性分子标记的识别可以解决肿瘤异质性引起的预后分化问题，为患者提供更合适有效的治疗。例如，喀斯特基因突变对转移性结直肠癌患者预后具有较高的预测准确性[5]，积累的研究已经确定了启动子的甲基化水平管理可用于预测替莫唑胺对胶质瘤患者的疗效[6］．然而，目前临床上还没有可用的HCC分子标记物。

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核受体，作为转录因子，调节生理活动，如侵袭、免疫耐受、代谢和炎症[7，8］．大量研究表明，肿瘤的发生和癌症进展通常伴随着PPAR信号通路的异常调控[9- - - - - -12］．此外，在近年来关于HCC预后标志物的研究中，反复报道了在预后不良的高危HCC患者中PPAR信号通路的调控异常[13- - - - - -15］．虽然PPAR信号通路已被报道为HCC的预后特征通路之一，但还没有人从该通路所涉及的基因中筛选出HCC的预后标志物。

在上述研究的背景下，本研究致力于从ppar相关基因中筛选出一种肝癌预后的多基因生物标志物。基于TCGA收录的365例HCC样本，我们分析了69个ppar相关基因的mRNA水平与患者总生存期的相关性。三种基因的组合(MMP1，HMGCS2,SLC27A5)被选为预后标志物。接下来，在GEO数据库中的三个验证集中评估和验证预后标记的性能。同时分析比较该指标与其他临床指标对HCC OS的影响。最后，开发了诺姆图，为预后多基因生物标志物的临床应用提供了可能性。

2.材料与方法

2.1.样本采集与数据预处理

选取TCGA队列中有存活信息的365例原发性HCC样本作为训练集。mRNA的3级值和HCC的相关临床资料来自Xena, University of California, Santa Cruz (UCSC)数据库。基因表达量为RSEM算法得到的计数。使用UCSC Xena HUGO probeMap将基因映射到参考基因组。具体的处理方法，请参考北卡罗来纳大学TCGA基因组表征中心网站。此外，去除75%以上患者中未表达且平均表达值小于1的低表达基因。

验证集为GEO数据库中的三个HCC数据集:GSE14520 ( )，GSE36376 ( )，和GSE76427 ( ）（表示样本数量)。我们选择归一化的mRNA数据。详细信息请参考GEO中三个数据集的“_series_matrix.txt”文件。根据微阵列测序平台提供的注释文件完成基因注释(即GSE14520对应GPL3921, GSE36376和GSE76427对应GPL10558)。当一个基因匹配多个探针时，选择多个探针的平均表达值作为该基因的表达值。

另外，从京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库(KEGG pathway ko03320)中获得69个PPAR信号通路相关基因。

2.2.筛选和评估预后基因

为了从69个PPAR信号通路相关基因中寻找有效的HCC预后基因组合，我们首先根据这69个基因的表达值，利用单变量Cox回归算法分析HCC患者的OS。基因 被认为是与肝细胞癌OS相关的基因。随后，以上一步筛选的候选基因为基础，采用lasso Cox回归算法，采用十倍交叉验证选择最佳惩罚系数，得到HCC预后基因的最佳组合[16］．

为了评估我们选择的预后基因组合的有效性，我们使用(1)建立预后模型:

在哪里表示基因的表达值 ；与此同时表示基因系数由多变量考克斯回归分析生成。计算每个HCC样本的风险评分根据式(1)，根据风险评分中位数将样本分为高危组和低危组。为了评估两组之间的生存差异，以显示我们的预后基因的效率，进行了对数秩检验分析。此外，我们评估了多基因标记在预测HCC 1-、3-和5年生存率方面的特异性和敏感性，并将其与其他临床指标如年龄、性别、AFP和TNM分期进行比较，使用的方法是时间依赖性受试者工作特征(ROC)曲线。多基因标记的预测效果最终在GSE14520、GSE36376和GSE76427数据集中得到验证。

2.3.检测多基因特征的独立性

为了了解这一多基因标记是否能够独立于其他临床常用的HCC预后指标，我们采用单因素和多因素Cox回归分析方法对HCC患者的生存进行分析。对于可能影响HCC预后的临床因素，我们选取了6个指标:年龄、性别、AFP、TNM分期、组织学分级、血管肿瘤浸润程度。风险评分和年龄作为连续变量，其余变量为分类变量。初步确定与生存期相关的临床指标;然后，用log-rank检验评估风险评分和其他生存相关临床指标之间的关系。将这些被确定为独立预测因子的变量构建诺姆图，通过校正真实值与预测值之间的一致性，对1-、3-和5-生存率的预测进行校正。

2.4.统计方法

本研究中所有分析均使用R软件(版本为3.6.1)。微阵列数据分析采用“GEOquery”包，差异基因筛选采用“edgeR”包。使用" survival:: Cox "函数进行单变量和多变量Cox分析，而使用基于web的工具(ESurv)进行lasso Cox回归分析[17］．“生存”包中的“survdiff”函数被用于log-rank检验，与时间相关的ROC分析也类似地使用“timeROC”包进行。使用“ggplot::heatmap”函数编制热图，使用“forestplot”包生成森林图，使用“rms”包建立并实现nomogram nomogram。

3.结果

3.1.肝癌的ppar相关预后基因

我们的研究是通过如图所示的程序进行的1．为了确定PPAR信号通路中与肝细胞癌OS相关的基因，我们分析了TCGA中365例原发性肝细胞癌样本的转录组数据，并使用单变量cox回归分析。25个ppar相关基因被鉴定为与肝细胞癌OS相关( )．最后，三个预后基因(包括MMP1，HMGCS2,SLC27A5)通过lasso Cox回归分析从候选预后基因中得到(图2)．

3.2.预后模型的建立和评价

然后建立一个预后模型来评估相关性MMP1，HMGCS2,SLC27A5基于这三个基因的表达作为HCC患者预后的预测因子。通过多变量Cox回归分析得到每个基因的回归系数，得到如下模型: ．然后，通过对TCGA数据库中的365例HCC患者样本进行风险评分来评估该模型的预测有效性1)．在本分析中，高危组患者的预后明显差于低危组患者( ；数字3(一个))．具体来说，高危患者的中位OS为17.8个月，而低危患者的中位OS为22.0个月。此外，还进行了时间相关的ROC分析，以评估1-、3-和5年的OS，得出相应的曲线下面积(AUC)值为0.702、0.694和0.652，与令人满意的模型性能一致( ；数字3 (b))．此外，高危评分与患者早期发生的死亡事件相关，与较高的评分相吻合MMP1表达式和更低HMGCS2而且SLC27A5表达式(图3 (c))．这些数据表明MMP1对HCC的预后不利，而HMGCS2而且SLC27A5是。为了比较我们的风险评分与其他临床因素的预后效果，基于患者1年的OS进行了时间依赖性ROC分析。在分析的危险因素中，风险评分表现出最好的预后疗效，其AUC值为0.702(图3 (d))．因此，这些数据表明我们能够成功地建立ppar相关的HCC预后模型MMP1，HMGCS2,SLC27A5可作为HCC患者预后的有效预测因子。

3.3.多基因标记预后有效性的验证

为了确保该多基因特征不因数据过拟合而具有预测性，我们使用三个独立数据集GSE14520、GSE36376和GSE76427对该特征进行了验证。高危组患者的中位OS (GSE14520中为32.8个月4(一))， GSE36376的63.7个月4 (d))， GSE76427为11.8个月4 (g))显著减少( ， ，而且 ）相对于低危组患者(GSE14520 53.7个月，GSE36376 82.7个月，GSE76427 16.6个月)，这与我们训练数据集的结果一致。在这三个数据集中，1、3和5年OS的AUC值分别为0.693、0.696和0.6404 (b)）;0.784, 0.693, 0.652(图4 (e)）;分别为0.566、0.632、0.7844 (h))．此外，与TCGA队列的结果一致，较高的风险评分与较早发生的患者死亡事件一致，且风险评分较高MMP1和更低的HMGCS2而且SLC27A5表达式(数据4 (c)，4 (f),4(我))．这些结果表明这个ppar相关的风险模型是跨平台的。

3.4.预后多基因特征的独立性

为了证实这一多基因标记的独立预测价值，我们接下来探讨了TCGA队列中HCC患者临床特征、风险评分和预后之间的关系。在单因素Cox回归分析中，TNM分期和风险评分均与患者OS显著相关( )．血管肿瘤侵袭与OS之间的相关性接近，但未达到显著性( )．然后将这三个因素作为协变量纳入多变量Cox回归分析，结果显示风险评分( ， ， ）TNM阶段( ， ， ）成为HCC患者OS的独立预后因素(图5(一个))．此外，我们发现患者是否表现为早期(I+II期，图5 (b))或晚期(III+IV期，图5 (c))疾病分期以及是否表现出血管侵犯(图5 (d)而且5 (e))是患者生存期的预测指标，强调了我们的多基因特征的独立预后价值。

3.5.Nomogram建立与评价

为了评估我们的模型可靠预测HCC临床预后的能力，我们接下来建立了一个nomogram nomogram，将TNM分期和风险评分作为与HCC患者1、3和5年OS相关的两个独立预后因素(图6(一))．该诺图得到的c指数值为0.709。这三个生存时间点的校准图还表明nomogram具有良好的预测能力6 (b))．因此，我们能够成功地确认我们的多基因签名的可靠性和潜在的临床价值。

4.讨论

ppar在包括HCC在内的癌症发展中的作用已被越来越多的研究文献揭示[18］．肝癌中ppar化疗敏感性的研究进展[19和PPARs靶基因与HCC患者生存期的相关性[20.]表明从ppar相关基因中寻找预后标志物更具临床意义。因此，在本研究中，为了寻找PPAR相关的HCC预后标志物，我们利用TCGA中收集的HCC患者数据，分析了参与PPAR信号通路的69个基因。最后，结合MMP1，HMGCS2,SLC27A5被筛选出来作为肝癌预后的多基因标记。我们选择的标记的预后表现良好，在GEO验证集的验证表明不存在样本偏倚。

本研究筛选出的三个ppar相关预后基因中，MMP1对HCC的预后不利，而HMGCS2而且SLC27A是有利的(图3 (c))．这些结果通过人类蛋白质图谱(HPA)的病理图谱(https://www.proteinatlas.org/)．MMP1是基质金属蛋白酶家族的一员，已被报道为癌症发展的危险因素[21- - - - - -23］．此外，Liao等人探讨了MMP1肝癌[24]，结果与本文一致。关于HMGCS2，研究人员证实它是一种癌症抑制剂[25］．肝细胞癌中HMGCS2伴预后不良，并促进癌细胞迁移[26］．SLC27A是肝脏中表达的极长链酰基辅酶a合成酶(VLCS)的同工酶。在目前的研究中，SLC27A肝细胞癌或其他任何癌症的研究均未见报道。总之，关于MMP1而且HMGCS2在本文中，已经有研究报道了它们在HCC预后中的可能作用。从目前的报道来看，我们选择的预后基因是相对可靠的。至于SLC27A虽然目前还没有报道其在HCC或其他癌症中的作用，但我们的研究提供了新的可能性。

5.结论

综上所述，我们发现本研究中选择的ppar相关多基因标记能够可靠地作为HCC预后的独立预测因子。由于在此进行了跨平台和跨批预测，该签名是可靠的。总的来说，我们的研究强调了临床前研究和基于个性化药物的HCC患者预后和治疗评估方法的实施的新的潜在方向。

数据可用性

mRNA和相应的表型数据来自UCSC Xena (https://tcga.xenahubs.net/download/TCGA.LIHC.sampleMap/HiSeqV2.gz；https://tcga.xenahubs.net/download/TCGA.LIHC.sampleMap/LIHC_clinicalMatrix)和GEO (GSE14520_GPL3921、GSE36376_GPL10558和GSE76427_GPL10558)。

利益冲突

作者宣称不存在竞争利益。

作者的贡献

徐文芳和陈震对这项工作做出了同样的贡献，被认为是共同第一作者。

致谢

本研究得到国家重点研发计划项目(No. 2018YFC0910700)、上海市科委(No. 17ZR1427000)和国家自然科学基金项目(No. 81772591)的资助。

补充材料

补充文件1:365例TCGA HCC标本的风险评分和分组。（补充材料）

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