PPAR的调查β/δ在人牙髓细胞:初步体外研究

文摘

控制炎症反应恢复组织内稳态维持牙活力是一个关键的一步从caries-affected病原体清除后牙齿组织。核过氧物酶体proliferator-activatedβ/δ受体(PPARβ/δ配体依赖性转录因子)是一种新兴抗炎作用在许多细胞和组织。然而,它的表达和功能了解甚少在人牙髓细胞(hDPCs)。因此,本研究评估PPARβ/δ表达和评估了抗炎作用诱发PPAR的激活β/δ在脂多糖(LPS)诱导hDPCs。我们的研究结果表明,PPAR hDPCs持续表达β/δ信使rna /蛋白质,与有限合伙人增加和治疗PPARβ/δ信使rna表达。选择性PPARβ/δ受体激动剂GW0742显著降低炎症相关的mRNA表达hDPCs (白细胞介素6,IL1β,TNFα,MMP1,MMP2)和RAW264.7细胞(白细胞介素6和Tnfα)。此外,PPARβ/δ受体激动剂减毒MMP2/9 hDPCs gelatinolytic活动。以前LPS-conditioned hDPCs增加RAW264.7细胞的迁移通过膜Transwell coculture系统。相反,预处理与GW0742显著降低巨噬细胞招聘。这些发现提供了第一批hDPCs表达PPAR的证据β/δ。此外,他们认为,PPAR的激活β/δ通过GW0742可以减弱一些体外细胞和分子方面相关的炎症过程,指出,调查其在牙髓发炎潜在目标的作用。

1。介绍

外伤性损伤和龋齿,自然防御反应发生在完成复杂。当控制和自限性,解决炎症刺激再生事件(1]。这些高潮在反动的牙质生产的主要成2),或者如果这些细胞死亡,在修复牙质生产的干细胞/祖细胞浆中组织(3]。信号事件与干细胞相关招聘和分化成新一代的odontoblast-like细胞是复杂的,不能完全理解。然而,现在明显的是,许多分子,经典作为炎症介质,包括细菌组件、活性氧(ROS),和细胞因子也参与修复反应,时间和浓度的方式(4- - - - - -6]。此外,激活相关的宗教上地炎症通路,比如NFκB和MAPK信号也可以支持的修复过程7,8]。可能,而相对低水平的细胞因子和生长因子可以刺激修复,大量的这些分子,更强烈的结果/持久细菌挑战和炎症,可以积极地抑制第三期(9]。这些发现,一起组织崩溃造成的免疫/炎症过程的课程在一个不能扩展的环境,强调需要再生方法基于治疗靶点减弱炎症。

过氧物酶体proliferator-activatedβ/δ受体(PPARβ/δ配体依赖性转录因子)是一个属于核激素受体(NR)总科。在内源性配体脂肪酸,前列腺素,白细胞三烯,而合成受体激动剂包括GW0742,选择性的高亲和性受体激动剂,广泛应用于研究探索PPAR的角色β/δ(10]。除了新陈代谢的主要功能,PPARβ/δ显示抗炎/免疫激活作用,负面干扰促炎的转录因子信号通路(11]。此外,PPARβ/δ可以在细胞增殖、分化、凋亡和血管生成,愈合和再生的关键细胞过程12]。在一起,这样使PPAR pleotropic功能β/δ一个潜在的治疗目标是探索完成上下文。然而,尽管被广泛表达,这NR尚未报道牙髓细胞,也没有相关的角色。因此,本研究的目的是检查人牙髓细胞是否表达PPAR (hDPCs)β/δ并了解其抗炎作用。

2。材料和方法

本研究经伦理委员会批准的巴西利亚大学健康科学学院(1400631),并从所有参与者获得知情同意。

2.1。细胞培养和治疗

主要hDPCs从提取nonerupted收获,caries-free第三臼齿部分根形成的11个年轻的捐助者(年龄在18到21),没有系统性疾病,和常规药物摄入的历史。这些标准被认为是由于结果再现性可以影响捐赠者牙齿条件,如发展阶段(13)或保留/牙爆发(14],供体年龄[15),和系统性疾病的存在16]。外植体建立的主要文化产物的方法(17]。短暂,拔牙后立即,牙科纸浆被移除,组织碎成小碎片,放在35毫米文化菜high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)补充20%胎牛血清(的边后卫;表达载体,卡尔斯巴德,CA)和抗生素(50 U /毫升青霉素和链霉素50毫克/毫升;Sigma-Aldrich)。碎片是稳定的玻璃盖玻片。细胞在37°C湿润孵化器孵化有限公司5%₂培养基是每2 - 3天更换一次。融合性的细胞亚文化与DMEM补充10%的边后卫和抗生素。所有程序都是在生物危害层流罩,在无菌条件下,遵循严格的实验室常规的最佳实践,以避免误认或交叉污染。细胞通过4被用于实验。RAW264.7小鼠巨噬细胞细胞系被从美国购买类型文化集合(写明ATCC®TIB71™,马纳萨斯,弗吉尼亚州)和保罗•韦伯博士提供的请卫理公会研究所,休斯顿,德克萨斯州。RAW264.7细胞保持在high-glucose DMEM包含10%的边后卫,50 U /毫升青霉素,50μ克/毫升链霉素。所有实验用无血清培养基、血清饥饿24小时之前每个实验。

GW0742(开曼化工、安阿伯、MI)溶解在二甲亚砜(DMSO)和细胞使用0.01,0.1和1.0μM GW0742或车辆(DMSO 0.1%)。这种选择基于浓度的EC50 1.1 nM,以前在transactivation化验报告(18],考虑其他的研究,用这种兴奋剂相关炎症(评估方面19,20.]。因为没有观察到的统计差异0.1% DMSO溶液治疗细胞和细胞之间只处理介质(补充图。1),GW0742被表达的影响相比,汽车集团。对炎症刺激,细胞暴露在脂多糖(LPS)大肠杆菌0111:B4 (Sigma-Aldrich)。2μg / mL LPS浓度被选中执行hDPC实验基于一个飞行员炎性基因表达分析。图的实验协议详细补充图。2。

2.2。免疫荧光染色

种子细胞( )到玻璃盖玻片和磷酸盐(PBS)冲洗,固定与甲醇在室温(RT)(10分钟),和permeabilized /阻塞隔夜Tween-20/1% (4°C,湿度0.1%牛血清白蛋白(BSA) / 5%正常山羊血清(Reactolab SA、Servion、瑞士)。然后,一夜之间,细胞被孵化(4°C,湿度)兔子反PPAR的β/δ(1:100年,sc - 7197,圣克鲁斯生物技术公司,达拉斯,TX)。最后,细胞被孵化与二次抗体Alexa萤石®594(表达载体)山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 200) 30分钟在RT风潮从曝光和保护。细胞核被贴上diamidino-phenyl-indole (DAPI英杰公司)5分钟,在显微镜载玻片和盖玻片是挂装使用Fluoromount-G®(SouthernBiotech、伯明翰、AL)。故事进行使用Axio成像仪M2显微镜(蔡司,哥廷根,德国)。

2.3。MTT细胞生存能力

hDPCs被播种( 细胞/厘米²)96年-与标准孔板中。24小时后,介质取代DMEM / 2%的边后卫包含GW0742(0.01、0.1或1.0μ米)或车辆1到6天,与媒介变化每2天。细胞生存能力评估通过添加0.5毫克/毫升MTT 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(Sigma-Aldrich)。200年随着产生的甲瓒晶体μL DMSO,光密度测量的波长570 nm DTX 800读者(贝克曼库尔特,CA)。

2.4。定量实时聚合酶链反应

总RNA分离使用三试剂(Sigma-Aldrich),其次是DNase我(Sigma-Aldrich)治疗。400 ng总RNA的互补脱氧核糖核酸合成了通过使用一个高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA)。在10定量PCR进行了一式三份μL反应通过使用PowerUp SYBR®绿色主人混合(应用生物系统公司)。基因和引物序列补充表中列出1。使用2相对量化计算^{- - - - - -ΔΔCt}方法(21]。更多细节,请参见补充文件(可用在这里)。

2.5。明胶Zymography

上层清液从治疗hDPCs收集和量化利用量子位®蛋白质分析工具包(表达载体)。样本与nonreducing样本混合缓冲(0.05 M Tris-HCL, pH值6.8,2%钠十二烷基硫酸盐(SDS)和5%甘油)和电泳(150 V, 4°C) 8% SDS-polyacrylamide凝胶1%明胶从猪的皮肤,a型(Sigma-Aldrich)。之后,凝胶被冲洗两次2.5% Triton x - 100 30分钟在一夜之间rt,然后他们被孵化(37°C)在一个反应缓冲区(50毫米Tris-HCL, pH值7.4,10毫米CaCl₂),用蒸馏水冲洗,沾0.1% Coomassie蓝色(PlusOne Coomassie平板电脑PhastGel®蓝色R350,通用电气医疗集团,芝加哥,IL)在30%甲醇/ 10%醋酸溶液30分钟,最后使退色20%醋酸溶液。带密度测量使用ImageJ软件(Rasband韦恩,美国国立卫生研究所的贝塞斯达,MD)。蛋白质的分子量估计精度+®万花筒®(Bio-Rad大力神,CA)标准。

2.6。趋化性试验

因为murine-derived RAW264.7先前响应来自其他细胞异型生物质的刺激,如人类牙周韧带干细胞(22- - - - - -24),人类骨肉瘤细胞(SaOS-2) [25),U87人类神经胶质瘤细胞(26],hDPCs [27),这个细胞模型中使用本研究测试hDPCs的趋化现象的影响在Transwell coculture系统(补充图。2 b)。短暂,预先处理这些hDPCs接触插入Transwell系统(聚碳酸酯膜插入6.5毫米直径和8μ米孔隙大小;康宁公司,纽约康宁)包含RAW264.7细胞( 在无血清培养基)。coculture 14小时后,nonmigratory RAW264.7细胞上的膜被移除,同时与甲醇(细胞被固定了20分钟,与DAPI染色(1:4000)5分钟。故事是在五个不同的领域(40 x)与Axio观察者D1(蔡司)。迁移细胞的数量用ImageJ测量软件。

2.7。统计分析

正态分布的数据被Shapiro-Wilk测试测试。统计组间的差异是由单向方差分析测试以及事后纽曼−Keuls或克鲁斯卡尔-沃利斯和事后Dunn的测试。未配对2-tailed学生的测试用于测试两组之间的显著差异。5.03软件GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)是用于统计分析和图形设计。统计分析的结果进行至少三种不同hDPCs在重复执行。 被接受为显著。

3所示。结果

3.1。hDPCs表示PPARβ/δ

PPARβ/δ信使rna表达了所有五个主hDPC文化评估(平均PPARβ/δCt, min-max: 22.07, 21.79 - -22.32 /平均水平β-肌动蛋白Ct min-max: 14.37, 13.69 - -14.99)。引物检测到一个乐队与适当的大小(77个基点),与预计的扩增子(图一致1(一))。免疫荧光试验证实PPARβ/δ蛋白表达和揭示主要重大核本地化(图1 (b))。

3.2。PPARβ/δ基因表达调节在LPS-Stimulated hDPCs

治疗2μg / mL有限合伙人轻微但显著增加PPARβ/δ级别( )(图1 (c))。类似但更明显增加了在过氧化氢(H₂O₂(补充图)刺激。3)。这种化合物被用来模拟一个更明显的炎症过程随着腐烂的病变的发展,增加活性氧的水平和细胞因子(28]。

3.3。PPARβ/δ受体激动剂减毒炎症基因的表达

的PPARβ/δ受体激动剂GW0742首次进行细胞毒性检测,数据显示,没有使用的浓度影响细胞的生存能力在任何时间点(图2(一个))。我们也测试的效果有限合伙人单独或与GW0742在细胞生存能力,我们没有发现任何统计vehicle-treated细胞和细胞之间的区别对待有限合伙人单独或与GW0742(补充图。4)。然后,我们评估白细胞介素6,IL1β,TNFα表达式。正如所料,暴露hDPCs 2μg / mL有限合伙人增加炎症基因的表达。相反,GW0742预处理LPS-induced显著降低白细胞介素6和IL1β在0.1μM, LPS-induced白细胞介素6,IL1β,TNFα在1.0μM浓度(图2 (b))。GW0742抑制促炎与H基因表达也被观察到₂O₂刺激(补充图。3 b)。结果与GW0742 RAW264.7细胞表明,预处理(0.01μ米)显著降低白细胞介素6和TnfαLPS-stimulated细胞水平,相比之下,仅接触有限合伙人(图2 (c))。

3.4。PPARβ/δ受体激动剂减毒MMP的表达和Gelatinolytic活动

暴露后细胞2μg / mL有限合伙人,数据显示增加MMP1水平,没有影响的MMP2表达式。hDPCs用GW0742预处理时,以上的差别明显对这些MMP1和MMP2水平在1.0μM浓度观察(图3(一个))。也发现了类似的结果₂O₂刺激(补充图。3 c)。根据基因表达数据,LPS刺激并不影响MMP2蛋白水解活性,但是1.0预处理μM GW0742 gelatinolytic活动引起了轻微的减少是统计学意义(图3 (b))。在这种情况下,我们没有检测MMP9的活动。然而,当hDPCs服用高剂量的有限合伙人(10μg / mL),一个苗条的观察蛋白水解MMP9的乐队。光密度分析显示略有增强MMP9活动曝光后细胞有限合伙人,和剂量依赖性降低蛋白水解乐队当细胞使用GW0742(图3 (c))。确认他们是基质金属蛋白酶与gelatinolytic活动,一个EDTA抑制试验进行(数据请求),不包括其他低具体活动凝胶基质金属蛋白酶(29日]。

3.5。hDPCs之前与GW0742抑制巨噬细胞的招聘条件

hDPCs先前条件2μg / mL有限合伙人招募了更多的巨噬细胞细胞,而控制细胞(DMSO 0.1%)。相反,当LPS-stimulated hDPCs使用1.0μM GW0742,招募RAW264.7细胞的数量通过Transwell膜显著降低(图4)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们提供了PPAR的最早证据β/δ在牙髓细胞信使rna和蛋白质表达。我们还透露,PPARβ/δ由特定的配体激活GW0742改善炎症概要文件由衰减某些方面相关的炎症过程,包括促炎细胞因子基因表达,MMP基因表达,白明胶酶活性和巨噬细胞的招募。

探索是否PPARβ/δhDPCs表达的,我们首先筛选mRNA表达通过实时qPCR和证实了通过免疫荧光蛋白表达和细胞定位。基底PPARβ/δ定位主要在细胞核hDPCs,协议与其他报告(30.,31日]。像许多NRs, PPARβ/δ细胞核通常是局部的,绑定到目标基因的启动子区域的异质二聚体类维生素a X受体。正规的,在缺乏受体激动剂,PPARβ/δ介导基因镇压,而引起基因表达存在的受体激动剂(32]。此外,PPAR激活β/δ还可以抑制基因独立于DNA结合,通过与转录因子相互作用,例如,(33]。因此,其定位在细胞核是兼容模式的行动,表明PPARβ/δ在hDPCs可能发挥一些作用。实际上,当hDPCs与LPS刺激,一个组件触发先天免疫响应的革兰氏阴性细菌(34,35),PPARβ/δ表达显著增加。这样的刺激与H后增加也被观察到₂O₂,表明这种NR的病理生理的作用。

获得洞察PPARβ/δ抗炎功能,我们LPS-stimulated预处理细胞三个noncytotoxic GW0742浓度,然后,白细胞介素6,IL1β,TNFα信使rna表达评估。在我们的研究中,治疗GW0742显著减少促炎细胞因子基因表达在hDPCs,与其他报道,赋予PPAR一致β/δ对转录监管职责和炎性介质生产(19,36- - - - - -39]。GW0742的潜在抑制促炎基因表达在hDPCs也支持第二个炎症在体外模型与H₂O₂。因为巨噬细胞似乎发挥重要作用在牙髓的炎症的恶化,我们下一个测试是否PPARβ/δ受体激动剂可以调节细胞因子基因表达在LPS-stimulated RAW264.7细胞系,和类似于牙髓细胞,减少白细胞介素6和Tnfα信使rna水平也被观察到。PPAR的机制β/δ配体可以降低炎症反应在hDPCs应该评估。然而,数据从巨噬细胞和其他细胞系建议NF的直接抑制作用κB和统计transactivation PPAR被激活β/δ没有DNA直接接触(19,37]。协会与转录阻遏蛋白B细胞淋巴瘤6 (BCL6)也被描述:unliganded PPARβ/δ可以用BCL6身体联系起来,从而防止BCL6抑制促炎的基因。相反,PPAR激动剂的存在β/δBCL6分离,释放它抑制促炎通路38,40]。规范直接转录诱导抗炎基因,如TGFβ(41)和抗氧化基因(38,39PPAR),可能是另一种方式激活β/δ发挥其行动。

因为牙髓组织破坏的行动涉及到细胞外基质分解蛋白水解酶,如基质金属蛋白酶,促进免疫细胞释放招聘(28),GW0742在MMP基因表达的影响和白明胶酶活动也被调查。在我们的研究中,预处理与1.0μM GW0742显著降低胶原酶的表达MMP1和白明胶酶MMP2。减少MMP2蛋白水解活性也观察到。有趣的是,有限合伙人没有增加MMP2基因表达和活动。我们认为这些结果后处理阶段评估(24小时)42]。MMP9水平相对较低,检测不到基础转录水平和蛋白质对大多数文化调查活动。然而,当我们LPS浓度增加,MMP9的蛋白水解活性。此外,预处理与GW0742有效地降低其活动。

最后,进一步探索生物PPAR的相关性β/δ激活,hDPCs以前对待GW0742 / LPS检测他们对招募巨噬细胞趋化现象的影响。在免疫细胞,巨噬细胞可能在健康和牙髓组织发炎(占主导地位43]。此外,数量增加龋齿的发展,发挥关键作用过程中纸浆炎症和坏死(44]。因此,严格监管的巨噬细胞招聘可能保护纸浆从过度的炎症和附带损害。这里,我们的研究表明:经过LPS-stimulated hDPCs GW0742明显改变他们趋药性的梯度,导致抑制RAW264.7迁移,与可能的表型改变,最近建议(27]。事实上,LPS-stimulated RAW264.7细胞cocultured hDPCs LPS-stimulated相比减少促炎因子的表达。同时,原始细胞cocultured DPSCs出现形态细长比没有hDPCs细胞培养,这似乎集群和圆形27]。

综上所述,我们的研究结果表明,GW0742有助于减弱纸浆促炎的环境,保护它免受过度炎症和毁灭性的破坏。一起消炎修复感应可能会进一步增加激活PPAR的治疗潜力β/δ在完成复杂。我们的试点试验的初步结果显示增加根瘤形成由GW0742-treated hDPCs(补充图。5)。先前的研究表明,ligand-activated PPARβ/δ诱导成骨细胞的成骨分化,增加骨结节形成和碱性磷酸酶的表达。他们建议PPARβ/δ可以放大Wnt-dependent和激活β-catenin-dependent信号通过转录调节低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (LRP5)和直接的互动β连环蛋白(45]。由于Wnt /的重要性β连环蛋白信号通路在牙本质的形成和修复,其与PPAR的交互β/δ可能是一个新的领域进行调查。

目前的研究也有一些局限性。预防性试验设计,尽管被广泛使用在激动的研究中,与临床实际不匹配。在一些实验样本量是另一个限制,并提出了进一步的研究支持再现性。此外,尽管我们取得了可喜的基因表达的结果,同样重要的是调查这些影响是否可复制的蛋白质含量。因此,未来的蛋白质检测的实验是必要的,以便更好地支持目前的结果。另外,还需要进一步的实验来阐明GW0742本身在基因表达的影响,探讨信号通路参与激活PPAR的抗炎活性β/δPPAR,探索如何激活β/δ改变hDPC趋化性,确认是否receptor-dependent或独立的影响。然而,我们的研究结果强调新的目标在未来的研究探索和开放的潜在治疗牙髓疾病的治疗的新途径,可用于与微生物控制。

5。结论

总之,本研究首次证明PPARβ/δ表达在人牙髓细胞,这表明PPAR激活β/δ在hDPCs防止促炎和抗炎作用MMP的基因表达,抑制白明胶酶活性和巨噬细胞招聘。

数据可用性

数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢当归阿莫林博士阿马托请提供GW0742,和阿尔巴极限博士和多米尼克•Hotton很好的帮助免疫荧光。我们还要感谢部门的研究和创新,巴西利亚大学(DPI /超窄带、巴西)。这项工作由CNPq支持,慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府,巴西(格兰特407851/2013-5数量和309989/2014-0)FAPDF, Fundacao de Apoio尽管做联邦直辖区,巴西(批准号407851/2013-5)。

补充材料

补充信息可能会发现这篇文章的在线版本:补充方法。定量实时聚合酶链反应:所有定量实时PCR检测进行了应用生物系统公司StepOnePlus™实时PCR系统,和StepOne v2.1软件生成的数据。循环条件50°C 2分钟,10分钟95°C,紧随其后的是40周期在95°C 15秒和60°C 1分钟。样本归一化beta-actin (hDPCs)或甘油醛3 -磷酸脱氢酶酶(Gapdh;RAW264.7细胞)。为了保证特异性,所有qPCR融化曲线获得产品。此外,标准曲线得到每一对引物扩增的效率进行评估。矿化分析:支流hDPCs在矿化培养介质(α最低基本培养基(αmem)与10%的边后卫,抗生素,10更易/ Lβ甘油磷酸盐、10 nmol / L地塞米松和50μ包含GW0742 g / mL抗坏血酸)(1.0μ米)或车辆(DMSO 0.01%)。28天后,细胞与PBS冲洗,用乙醇固定在RT 30分钟,和彩色10分钟2%茜素红S (Sigma-Aldrich)解决方案,pH值为4.2,在沿细胞然后用蒸馏水冲洗3次,以减少非特异性染色。这个实验进行了一式三份。补充表1基因和引物序列。补充图1 MTT细胞生存能力分析评估DMSO的安全。hDPCs孵化DMEM / 2%的边后卫不及时治疗或含有0.1% DMSO (hDPCs)和代谢活动期间每日评估通过MTT比色测定6天。补充图2图实验协议GW0742治疗后炎症与LPS刺激hDPCs (2μg / mL)和RAW264.7细胞(100 ng / mL), (a)基因表达和gelatinolytic活动,和(b)趋化性试验使用coculture Transwell系统。与300年补充图3 (a)治疗μM H₂O₂显著增加PPARβ/δ信使rna水平;预处理与GW0742压抑(b)白细胞介素6,IL1β,TNFα和(c)MMP1和MMP2在H基因表达₂O₂刺激hDPCs ( ;^#与控制;与H₂O₂; )。补充图4 MTT细胞生存能力分析评估有限合伙人和GW0742安全。hDPCs孵化DMEM / 2%的边后卫包含DMSO(对照组)或有限合伙人(0.1 0.1%μ克/毫升或10μg / mL)单独或与三个GW0742浓度(0.01μ0.1米,μ米,或1.0μ米),代谢活动是通过MTT比色测定评估每天6天。0.1 (a)治疗μ克/毫升或10μg / mL有限合伙人并不影响细胞的生存能力在任何时间点被认为是( 通过单向方差分析和事后纽曼−Keuls)。0.1 (b, c)治疗μ克/毫升或10μg / mL有限合伙人与GW0742没有损害细胞生存能力在任何时间点被认为是( 通过单向方差分析和事后纽曼−Keuls)。 。补充图5 GW0742-activated PPARβ/δ增加钙化结节形成。初步( )茜素红染色hDPCs 28天后骨的/牙发生分化的存在表明浓度GW0742或车辆(DMSO 0.01%)。矿化介质:αMEM 10%的边后卫,10毫米β甘油磷酸盐、10 nM地塞米松和50μ克/毫升抗坏血酸。(补充材料)

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