lncRNA HHIP-AS1促进成骨分化潜能，抑制牙周韧带干细胞迁移能力

摘要

牙槽骨在正畸力作用下的重塑是通过牙周韧带干细胞(PDLSCs)实现的，其对机械载荷敏感。如何调节PDLSCs的功能，是正畸牙运动中骨重塑的关键问题。本研究旨在探讨lncRNA刺猬相互作用蛋白反义RNA 1 (HHIP-AS1)在PDLSCs功能调控中的作用。首先，在持续压缩压力下，PDLSCs中HHIP-AS1表达下调。然后，我们发现碱性磷酸酶活性，在体外HHIP-AS1增加了PDLSCs中骨唾液蛋白、骨钙素和成骨蛋白的表达水平。划痕迁移和跨孔趋化实验结果显示，HHIP-AS1抑制了PDLSCs的迁移和趋化能力。此外，RNA测序数据显示，在hhip - as1缺失的PDLSCs中，356个mrna和14个lncrna上调，包括受体酪氨酸激酶样孤儿受体2和核富集的丰富转录本1，而185个mrna和6个lncrna下调，包括成纤维细胞生长因子5和LINC00973。生物信息学分析揭示了与HHIP-AS1功能相关的几个生物学过程和信号通路，包括PI3K-Akt信号通路和JAK-STAT信号通路。综上所述，我们的研究结果表明，在压缩压力下，HHIP-AS1在PDLSCs中被下调，它促进了成骨分化潜能，抑制了PDLSCs的迁移和趋化能力。因此，在正畸治疗过程中，HHIP-AS1可能是加速牙齿运动的潜在靶点。

1.介绍

正畸治疗是一个耗时的过程，通常需要2 - 3年的时间。较长的治疗周期往往伴随着较高的并发症风险，如牙釉质脱矿、粘膜溃疡、龋齿、牙龈衰退、牙根吸收等[1- - - - - -7]。加速正畸牙齿运动(OTM)，尽快实现健康、功能、稳定、美观的治疗目标，是正畸医生和患者的共同追求。目前，加速OTM的辅助干预措施有很多。这些措施包括手术干预和非手术干预。手术干预包括牙周加速成骨正畸治疗[8，牙周韧带牵张成骨和牙槽骨牵张成骨[9，周向骨上纤维切开术[10]。非手术干预包括激光[11)、振动(12)、药物(13],超声波[14，以及电磁疗法[15]。然而，目前的辅助干预措施是创伤性的或不能完全加速牙齿移动。此外，这些措施在正畸诊所中都没有被认为是常规疗法。

在OTM过程中，施加在牙齿上的力通过牙周韧带(PDL)传递到牙槽骨。研究表明，压迫导致骨吸收，这是一个速率限制的过程，而张力导致骨形成。PDL重塑，结合牙槽骨的局部吸收和沉积，使牙齿在正畸施力过程中能够移动[16,17]。此外，具有强大自我更新潜能和多重分化潜能的牙周韧带干细胞(PDLSCs)可以形成新的骨、牙骨质和牙周韧带在体外和在活的有机体内(18,19]。PDLSCs被认为是牙周组织重建和重塑的种子细胞。此外，PDLSCs对机械负荷敏感，正畸力对牙槽骨重塑的作用是通过PDLSCs实现的[20.]。PDGFR阳性信号α在OTM大鼠模型正畸治疗过程中，PDL中的nestin逐渐增强，随后在压力侧下降，表明PDLSCs参与OTM [21]。在体外研究表明，应用不同类型和大小的力刺激，包括张力和压缩，可以显著调节PDLSCs的成骨分化[21- - - - - -23]。因此，确定PDLSCs成骨分化的关键靶点和调控机制，有利于正畸条件下的骨重塑。

长链非编码RNA (Long noncoding RNAs, lncrna)是长度超过200 nt的非编码RNA分子，参与体内许多重要的调控过程。lncrna作用的机制主要涉及信号、诱骗、引导和支架[24]。根据已有研究，lncrna主要通过转录、转录后和表观遗传调控基因表达[25- - - - - -27]。而且，lncRNAs可以通过多种方式调节PDLSCs的成骨分化。一些lncrna促进PDLSCs的成骨分化，而另一些则抑制这一功能;所有这些lncrna都在骨再生和重塑中发挥着关键作用[28]。例如，lncRNA TUG1作为miR-222-3p与靶基因竞争miR-222-3p结合位点的“海绵”，抑制了miR-222-3p对Smad2/7的负调控，促进PDLSCs成骨分化[29]。然后，下调lncRNA ANCR可激活典型的Wnt信号通路，促进PDLSCs成骨[30.]。此外，lncRNA刺猬相互作用蛋白反义RNA 1 (HHIP-AS1)是一种新发现的位于人类4号染色体上的lncRNA，主要在18种组织中表达[31]。HHIP-AS1可促进肝癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖、迁移和趋化性[31]。在我们之前的研究中，我们发现在骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中，HHIP-AS1表达下调[32]。此外，HHIP-AS1在PDLSCs中的表达低于骨髓间充质干细胞[33]。因此，推测HHIP-AS1可能与PDLSCs的成骨分化有关。然而，HHIP-AS1在PDLSCs中的作用和机制尚不明确。

在本研究中，我们探讨了压缩压力下HHIP-AS1在PDLSCs中的表达，以及HHIP-AS1在PDLSCs成骨分化、迁移和趋化过程中的作用。通过RNA测序(RNA-seq)和生物信息学分析，研究了HHIP-AS1的潜在机制。通过这项研究，我们获得了一些阐明HHIP-AS1在PDLSCs中的潜在功能和机制的原始见解。

2.材料和方法

2.1.细胞培养

本研究中使用的PDLSCs是从人类阻生第三磨牙中分离出来的。本研究在患者允许的情况下，在首都医科大学附属北京口腔医院指导下进行。首先，用75%乙醇对牙齿进行消毒，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗牙齿;接下来，将细胞进行分离、培养和鉴定，如前所述[34- - - - - -36]。简单地说，将牙周韧带从牙根中部的三分之一轻轻分离后，用含有3mg /mL I型胶原酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和4mg /mL液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)的溶液在37°C下消化60分钟。然后，使用70毫米过滤器(Nest，无锡，中国)成功获得单细胞悬浮液。细胞在MEM Alpha培养基(Gibco, Carlsbad, CA, USA)中培养，添加10,000单位/mL的青霉素-链霉素(Gibco)、200 mM l -谷氨酰胺(Gibco)和10%的胎牛血清(FBS;Gibco)在37°C和低于5%二氧化碳的培养箱中培养。在接下来的实验中使用了3-5通道中的PDLSCs。

为了诱导成骨分化， 将细胞播种到6孔板的每一个孔中。一旦细胞达到80%的合流度，培养基就转变为含有2 mM的成骨诱导培养基β甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich), 100年μM/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich)， 10 nM地塞米松(Sigma-Aldrich)， 1.8 mM KH₂阿宝₄(Sigma-Aldrich)，期限不超过14天。

2.2.质粒构建与病毒感染

全长人类hihip - as1结构是按照标准协议创建的，并通过基因测序进行验证。将HHIP-AS1的cDNA亚克隆到LV5慢病毒载体(GenePharma Company, Suzhou, China)中进行过表达。随后，利用LV3慢病毒载体(GenePharma)构建了HHIP-AS1的短发夹RNA (shRNA)。将PDLSCs在100 mm培养皿中接种培养过夜，用慢病毒和6μg/mL聚苯乙烯(Sigma-Aldrich) 12 h。然后，在感染72 h后用适当的抗生素筛选转染的PDLSCs。shRNA的靶序列如下:对照shRNA (Consh)， 5 -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3 ,和HHIP-AS1 shRNA (HHIP-AS1sh)， 5 -GCACCAATGCATCTTGTATGA-3 。

2.3.Real-Time逆转录酶聚合酶链反应(Real-Time RT-PCR)

RNA提取、cDNA合成和real-time RT-PCR如前所述[37]。使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从PDLSCs中提取总RNA，然后用1μg根据制造商的协议(Invitrogen)，使用随机引物和逆转录酶的RNA oligo (dT)等分。cDNA扩增使用的是定量SYBR绿色PCR试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)和Icycler iQ多色实时PCR检测系统。所有样本均进行三次重复检测。2^−ΔΔCT方法确定每个基因的表达水平，归一化为GAPDH的表达水平。本研究所用引物见表S1。

2.4.免疫印迹分析

使用RIPA裂解缓冲液从PDLSCs中提取总蛋白。按照前面描述的方法进行Western blot [35]。等量的蛋白质(25μG)制备凝胶电泳。样品在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。然后使用半干电泳转移装置(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)将它们转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂乳汁将膜阻塞1小时，随后在4°C下与一抗孵育过夜。然后，用带有Tween的tris缓冲盐水冲洗膜三次，并与辣根过氧化物酶结合的二抗(Promega, Madison, WI, USA)孵育。在此之后，使用增强型化学发光检测试剂(Applygen，北京，中国)对条带进行可视化。GAPDH作为一种内部控制。我们使用了以下主要抗体:骨唾液蛋白(BSP;猫没有。bs-2668R，毕斯，北京，中国)，骨钙素(OCN; Cat No. bs-0470R, Bioss), osterix (OSX; Cat No. bs-1110R, Bioss), and GAPDH (Cat No. 60004-1-Ig; Proteintech, Rosemont, IL, USA).

2.5.连续压缩压力试验

首先，圆形玻璃板(直径30毫米，厚度4毫米，密度为 )都是定制和消毒的。在细胞密度为的条件下接种PDLSCs 并在6孔板的每一孔中培养。然后，我们在单孔中放置一块玻璃板在PDLSCs上，持续0、2、4和6小时，使PDLSCs承受1 g/cm的持续压缩压力²。对照组施加0 h压力。

2.6.碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色

成骨诱导5天后，根据制造商的方案，使用ALP活性试剂盒(Sigma-Aldrich)量化ALP活性。然后，在成骨诱导14天后，用70%乙醇固定细胞，并用2%茜素红(Sigma-Aldrich)染色评估矿化程度。接下来，细胞被10%的十六烷基吡啶氯化染色约30分钟，以量化钙水平。在多板读取器上562 nm吸光度下测量OD值，然后与标准钙曲线进行比较，以确定钙浓度。

2.7.抓迁移分析

PDLSCs被植入到6孔板的每一个孔中 细胞密度。一个1000μL移液管尖端被用来沿着细胞层的直径制造划痕。用PBS冲洗孔后，用无血清培养基取代常规培养基。在0、24和48小时后，使用显微镜(Olympus) ×40放大倍率捕获图像。伤口的相对宽度由Image-Pro v1.49(美国国立卫生研究院)计算。

2.8.Transwell趋化性试验

Transwell chambers (Corning Costar, MA, USA)与8μ采用M孔径膜染色。在上面的腔室中， 细胞在100年μL无血清培养基被分配，在底部腔室，600μL MEM Alpha培养基含10% FBS。48 h后，底部室中的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染色液染色。最后，在×200放大倍率显微镜(Olympus)的辅助下，对随机选择的场中转移的细胞数量进行计数。

2.9.RNA-seq的生物信息学分析

hhip - as1耗尽的PDLSCs被用于RNA-seq。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。随后，RNA-seq和生物信息学分析由广州艾博生物科技有限公司进行。中国RNA文库由Epi™迷你长RNA-seq试剂盒构建，仪器模型采用Illumina NovaSeq 6000。应用DESeq2算法筛选差异表达基因，按照以下标准进行显著性分析和错误发现率(FDR)分析: ( ), 。此外，我们还进行了GO分析，以解释差异表达基因的生物学功能。GO注释下载于基因本体论(http://www.geneontology.org/), NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt (http://www.uniprot.org/) [38]。根据KEGG数据库进行通路分析，识别差异表达基因的显著通路[39]。Fisher精确测试用于识别重要的氧化石墨烯类别和路径。显著性是由价值和罗斯福。

2.10.统计分析

数据采用SPSS 22版统计软件进行分析。统计显著性，设为 ,是由单向方差分析或Student -测试。所有实验均独立进行三次。

3.结果

3.1.持续压缩压力下，PDLSCs中HHIP-AS1表达下调

首先，我们评估了在压力作用下PDLSCs中HHIP-AS1表达的变化，这模拟了OTM期间的机械条件。Real-time RT-PCR结果显示，与无压力的PDLSCs相比，在持续压缩压力下的2、4、6 h, PDLSCs中的HHIP-AS1表达下调(图1(一))。

3.2.HHIP-AS1促进PDLSCs的成骨分化潜能

为了进一步研究HHIP-AS1在PDLSCs成骨分化中的作用，我们利用HHIP-AS1 shRNA慢病毒敲除PDLSCs中HHIP-AS1的表达。转染后的PDLSCs用2μg/mL嘌呤霉素，3天。实时RT-PCR结果显示，HHIP-AS1在PDLSCs中被有效沉默(图1 (b))。与对照组(Consh组)相比，ALP活性测定结果显示，HHIP-AS1敲低使成骨诱导后5天ALP活性降低(图1 (c))。此外，与Consh组相比，诱导2周后PDLSCs的矿化被HHIP-AS1耗尽抑制。这是通过茜素红染色和钙定量测量(图1 (d)和1 (e))。此外，Western blot实验显示，与Consh组相比，hhip - as1缺失的PDLSCs在成骨诱导1周后，成骨相关基因，包括BSP和OCN下调(图1 (f))。Western blot结果还显示，在hhip - as1缺失的PDLSCs中，关键转录因子OSX的表达明显降低(图1 (f))。

随后，用HHIP-AS1和空载体转染PDLSCs。选择含有2 .μg/mL嘌呤霉素，HHIP-AS1过表达效率通过real-time RT-PCR确认(图2(一个))。成骨诱导5天后，与对照组(Vector组)相比，PDLSCs中HHIP-AS1的过表达增强了ALP活性(图2 (b))。接下来，与诱导2周后的Vector组相比，HHIP-AS1过表达促进了PDLSCs的矿化(图2 (c)和2 (d))。此外，在hhip - as1过表达的PDLSCs中，诱导1周后BSP、OCN和OSX的表达显著上调(图2 (e))。

3.3.HHIP-AS1抑制PDLSCs的迁移和趋化能力

接下来，我们探讨了HHIP-AS1对细胞迁移和趋化作用的影响。划痕迁移实验和定量分析证实，在24和48 h时，hhip - as1缺失的PDLSCs比Consh组具有更强的迁移能力(图3(一个)和3 (b))。此外，transwell趋化性试验和定量分析的结果也显示，在48 h时，hhip - as1耗尽的PDLSCs比Consh组具有更强的趋化能力(图3 (c)和3 (d))。

相比之下，划痕迁移实验和定量分析结果显示，HHIP-AS1过表达抑制了PDLSCs在24和48 h的迁移能力(图4(一)和4 (b))。同时，transwell趋化性试验和定量分析结果显示，HHIP-AS1过表达抑制了48 h的趋化能力(图4 (c)和4 (d))。

3.4.hhip - as1耗尽的PDLSCs中差异表达mrna和lncrna的分析

hhip - as1缺失的PDLSCs中差异表达的mRNAs和lncRNAs通过RNA-seq进行鉴定。共检测到541个差异表达的蛋白编码基因( , );其中，与Consh组相比，hhip - as1缺失的PDLSCs中有356个表达上调，185个表达下调(表S2)。此外，还检测到20种差异表达lncrna ( , );其中，与Consh组相比，hhip - as1缺失的PDLSCs中有14个表达上调，6个表达下调(表S3)。

为确保RNA-seq数据的可靠性，我们随机选取3个差异表达的mrna(受体酪氨酸激酶样孤儿受体2 (ROR2)、C-X-C基序趋化因子配体12 (CXCL12)和成纤维细胞生长因子5 (FGF5))和2个差异表达的lncrna(核富集丰富转录本1 (NEAT1)和LINC00973)，通过实时RT-PCR进行表达检测。实时RT-PCR结果证实，HHIP-AS1敲低导致ROR2表达上调(图5(一个)), CXCL12(图5 (b))和NEAT1(图5 (d))和FGF5的下调(图5 (c))和LINC00973(图5 (e)在PDLSCs)。此外，我们重复了连续压缩压力实验，发现当PDLSCs受到持续压缩压力刺激时，在压力下2小时，ROR2和CXCL12均显著上调，FGF5显著下调(图S1)。

3.5.RNA-seq数据的生物信息学分析

首先，从生物过程、分子功能、细胞成分三个方面进行GO分析(图S2)。对于生物过程，我们获得了535个上调的GO函数和360个下调的GO函数( )(表S4)。的负对数表示基因表达与生物过程之间的相关性值(−LgP)。气泡图清楚地说明了前20个丰富的GO术语(图6(一))。在这些丰富的术语中，一些可能与成骨分化相关的重要上调氧化石墨烯功能包括细胞外基质(ECM)组织、细胞粘附和骨骼系统发育，而一些可能与成骨分化相关的重要下调氧化石墨烯功能包括胞嘧啶上的DNA甲基化、细胞增殖调节和细胞趋化性(表S4)。

接下来，通过KEGG分析，确定了连接差异表达基因与生物学功能的显著改变通路。检测到24条上调通路和20条下调通路，这些通路可能在HHIP-AS1调控过程中发挥关键作用( )(表S5,图S3)。前20条富集路径被描述为气泡图(图6 (b))。在这些信号通路中，与成骨分化相关的上调通路包括PI3K-Akt信号通路、钙信号通路、Hedgehog信号通路。此外，与成骨分化相关的下调通路为TNF信号通路、JAK-STAT信号通路和细胞周期(表S5)。

4.讨论

为了在OTM中辅助牙槽骨重塑，有必要研究PDLSCs在机械刺激下的调节及其相关机制。在本研究中，将PDLSCs置于1 g/cm的持续压缩压力下²2、4、6 h，模拟OTM期间的压缩条件。我们发现，在压缩压力下，PDLSCs中HHIP-AS1表达下调。有研究表明，施加1 g/cm的压缩力后²12和24小时后，PDLSCs形态拉长，成骨标志物I型胶原(Col-I)在PDLSCs中被抑制。然而，在撤力后，形态和Col-I表达都恢复了[40]。因此，压缩压力导致了HHIP-AS1的下调，这可能进一步导致成骨分化的抑制。为了验证这一假设，我们探索了HHIP-AS1在PDLSCs成骨分化中的作用。最初，我们发现HHIP-AS1敲低抑制了成骨分化的早期标记物ALP活性，并且在体外矿化，成骨分化的晚期标志。我们进一步发现，HHIP-AS1过表达促进了ALP活性和在体外矿化。此外，HHIP-AS1还上调了PDLSCs中成骨分化标志物的表达，包括BSP和OCN，以及转录因子OSX。这些结果表明，HHIP-AS1增强了PDLSCs的成骨分化，而HHIP-AS1的下调导致了成骨分化的抑制。

除了矿化能力，我们还进一步研究了HHIP-AS1在PDLSCs迁移和趋化能力中的作用。划痕迁移实验、transwell趋化实验和定量分析的结果表明，HHIP-AS1敲低促进了PDLSCs的迁移和趋化能力，而HHIP-AS1过表达抑制了迁移和趋化能力。这与前人对肝癌细胞的研究中HHIP-AS1的功能一致[31]。而且，有报道称，施加外力会扰乱牙周组织合成和降解之间的平衡，激活PDL和牙槽骨重塑导致牙齿运动。在吸收方面，PDL和牙槽骨降解，为牙齿运动提供空间[17]。综上所述，我们的研究结果表明，在压缩方面，HHIP-AS1的下调导致了PDLSCs的骨形成减少，并增强了PDLSCs的迁移和趋化能力，从而促进了PDLSCs的运动，从而加速了牙齿的运动。为了验证这些发现，我们将在动物模型中进行进一步的研究。

此外，为了确定HHIP-AS1作用的机制，进行了RNA-seq和后续的生物信息学分析。RNA-seq在hhip - as1缺失的PDLSCs中鉴定出541个差异表达的mrna和20个差异表达的lncrna。其中，356个mrna和14个lncrna上调，包括ROR2和NEAT1, 185个mrna和6个lncrna下调，包括FGF5和LINC00973。此外，通过real-time RT-PCR检测ROR2、CXCL12、FGF5、NEAT1和LINC00973的表达，证实了RNA-seq的结果。ROR2属于受体酪氨酸激酶家族，可以启动间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞谱系的承诺，并在成骨细胞发生的早期和晚期促进分化。使用老鼠的头颅骨体外在器官培养模型中，证明了ROR2的这些影响导致骨形成增加[41]。然而，这与我们发现的HHIP-AS1敲低促进ROR2表达，抑制成骨分化并不一致。同时，趋化因子CXCL12影响MSCs的迁移、生长、存活和分化。CXCL12/CXCR4轴通过招募多功能MSCs进行骨再生，在骨骼系统的发育和维持中发挥了重要作用[42]。黄等人。[43]用CXCL12和骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)治疗小鼠颅骨临界尺寸缺损。新骨再生程度最高，表现为较强的成骨分化和增强的细胞迁移效应。在我们的研究中，虽然HHIP-AS1耗竭导致CXCL12上调，从而促进迁移和趋化，但对成骨的抑制与CXCL12的功能并不一致。然后，新近发现的lncRNA NEAT1通过调节miR-29b-3p/BMP1轴促进BMSCs成骨分化;这表明它在骨代谢中的潜在作用与我们的结果相反[44]。有趣的是，我们发现在持续压缩压力刺激的PDLSCs中，ROR2和CXCL12均显著上调。有时，该基因在不同的细胞或组织中，在不同的条件下，发挥着不同的作用。在OTM过程中，ROR2、CXCL12和NEAT1可能在PDLSCs中发挥不同的作用。我们将进行进一步的研究来验证这一假设。此外，FGF5在h髋关节- as1缺失的PDLSCs中表达减少，在持续压缩压力刺激的PDLSCs中也显著下调。一项研究表明，FGF5通过细胞外信号调节激酶1/2激活促进细胞增殖，并增强扁桃体来源的MSCs的成骨分化[45]。因此，我们推测FGF5在介导HHIP-AS1功能中发挥了重要作用。此外，在hhip - as1缺失的PDLSCs中，分泌磷酸化蛋白1 (SPP1)和spondin 1 (SPON1)的表达上调。研究证明，SPP1是触发牙齿运动过程中机械负荷引起的骨质减少状态的一个因素[46,47]。同时，SPON1在压迫下上调，被证实为骨量的负调控因子[48,49]。这些结果表明，SPP1和SPON1可能也是HHIP-AS1的关键下游基因，可能对PDLSCs的调控有重要影响，应该在进一步的研究中进行探索。

此外，从个体的发育到疾病的发生，各种生物过程都被证明受到lncrna的影响[50,51]。为了阐明PDLSCs中HHIP-AS1的潜在机制，我们进行了GO分析，以探索差异表达mrna参与的生物学过程。结果表明，ECM组织、细胞黏附、骨骼系统发育、胞嘧啶上的DNA甲基化、细胞增殖调控和细胞趋化性是GO的首要术语，并与PDLSCs中HHIP-AS1的调控有关。此外，通路分析显示，在HHIP-AS1缺失的PDLSCs中，PI3K/Akt信号通路、钙信号通路、Hedgehog信号通路上调，而TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞周期下调，这也与PDLSCs中HHIP-AS1的调控有关。密集的研究阐明了许多关键信号通路参与调控MSCs的成骨分化，且多条信号通路通常相互作用，形成复杂的调控网络。在我们的研究中，HHIP-AS1缺失抑制了成骨分化潜能，上调了PI3K/Akt信号通路。同样，miR-let-7c-5p抑制HMGA2和PI3K/Akt信号通路的表达，促进牙髓干细胞在脂多糖介导的炎症环境中成骨分化[52]。此外，HHIP-AS1耗竭导致JAK-STAT信号通路下调。最近的一项研究表明BMSCs通过JAK-STAT信号通路促进兔胫骨骨折的愈合[53]。这些结果表明，PI3K/Akt和JAK-STAT信号通路是PDLSCs中HHIP-AS1调控的关键通路。总的来说，HHIP-AS1通过调节下游基因和相关通路，对PDLSCs的生物学功能有显著影响。然而，其潜在的分子机制仍有待进一步探索。

5.结论

总之，我们发现在压缩压力下，PDLSCs中HHIP-AS1表达下调。此外，HHIP-AS1促进了PDLSCs的成骨分化潜能，抑制了PDLSCs的迁移和趋化能力。RNA-seq数据的生物信息学分析揭示了HHIP-AS1的候选下游基因和与HHIP-AS1调控相关的关键信号通路。总的来说，我们的研究结果为正畸治疗机械条件下PDLSCs的功能修饰和骨重塑提供了一个潜在的靶点和理论基础。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明，关于这篇论文的发表不存在利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金项目(81970964、81771108)、中国科学院医学科学创新基金项目(2019-I2M-5-031至Z.P.F.)、江西省科技厅重点项目(20171BBH80012至J.G.)资助。

补充材料

补充1。表S1: real-time RT-PCR中使用的引物序列。

补充2。表S2: hhip - as1耗尽的PDLSCs中差异表达的mrna。

补充3。表S3: hhip - as1缺失的PDLSCs中差异表达的lncrna。

补充4。图S1:压缩压力下ROR2和CXCL12上调，FGF5下调。Real-time RT-PCR结果显示，在连续压缩压力作用2 h时，ROR2 (a)、CXCL12 (b)和FGF5 (c)的表达。以GAPDH作为内对照。学生的 -进行检验以确定统计学显著性。所有误差条表示SD ( )。 ; 。

补充5。图S2:从生物过程、分子功能、细胞成分等方面对差异表达基因进行显著GO分析。(a)上调的GO项。(b)下调的氧化石墨烯条款。

补充6。表S4: hhip - as1缺失的PDLSCs中GO功能的显著上调和下调。

补充7。表S5: hhip - as1缺失的PDLSCs中显著上调和下调的通路。

补充8。图S3: hhip - as1缺失的PDLSCs中差异表达基因的显著途径分析。(一)调节通路。(b)下调通路。

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