ngf负载壳聚糖/肝素纳米颗粒表面修饰提高心血管支架生物相容性

摘要

晚期血栓形成和再狭窄仍然是药物洗脱支架安全性的主要挑战。生物功能修饰使血管表面具有选择性抗凝作用，促进内皮细胞再生已成为近年来的研究热点。本研究发现壳聚糖和肝素通过自发静电相互作用形成三维纳米颗粒。基于肝素与神经生长因子(NGF)的特异性结合特性，构建了一种新型的神经生长因子负载的肝素/壳聚糖纳米颗粒进行表面修饰。材料表征结果表明，纳米颗粒成功地固定在材料表面。体外血液相容性和内皮细胞相容性试验表明，修饰后的表面可选择性抑制血小板粘附和平滑肌细胞过度增殖，同时通过促进内皮细胞增殖和增强内皮祖细胞动员来加速内皮化。

1.简介

药物洗脱支架(DES)系统经皮冠状动脉介入治疗是心血管疾病的主要治疗方法。通常DES主要由金属支架、抗增殖药物(如雷帕霉素和紫杉醇)和聚合物涂层组成。然而，由于聚合物的生物相容性不足和抗增殖药物的非特异性作用，支架植入后可能发生内皮愈合延迟和慢性炎症，增加支架内晚期血栓和再狭窄的风险[1］．因此，研究者认为对血管支架表面进行生物功能修饰有助于提高支架的生物相容性，减少术后并发症的发生。

血管内皮是血液与血管组织之间的天然屏障，介导血液与组织之间的代谢交换，可合成多种生物活性物质，保证血管的正常收缩和舒张，抑制凝血，维持平滑肌细胞的生物功能[2，3.］．因此，人们普遍认为在支架表面快速形成完整的内皮层是降低植入后并发症风险的理想方法[4］．自从内皮祖细胞(内皮祖细胞)被发现以来，血管内皮损伤后的再生愈合机制被重新定义为内皮祖细胞从周围血管组织增殖和迁移与内皮祖细胞从骨髓动员和归巢的共同作用。内皮化过程内皮化的过程在活的有机体内很大程度上取决于细胞因子和细胞外基质蛋白对ECs和EPCs的有序协同作用[5，6］．因此，各种细胞因子和粘附蛋白，包括VEGF [7], SDF-1 [8)、层粘连蛋白(9),胶原蛋白(10和纤维连接蛋白[11]被纳入材料表面以加速内皮化。然而，蛋白质和细胞因子作为具有生物活性的大分子，其半衰期较短在活的有机体内以及如何防止生物大分子的快速失活在活的有机体内仍然是个问题，急需解决。

近年来，多功能纳米粒子系统在控制生物分子释放和调节血管细胞行为方面显示出巨大的潜力。与其他控释系统相比，纳米颗粒系统独特的纳米效应大大提高了载药能力，并能将活性分子与周围环境分离，避免快速失活。为此，研究人员提出在心血管材料表面构建具有三维结构的生物功能纳米涂层，增强生物活性，延长生物分子的作用时间，从而实现对血管内生物反应的长期有效调控[12］．周等人。[13]将vegf负载的聚己内酯(PCL)纳米颗粒共价固定在脱细胞支架上，发现纳米涂层可以显著减少生物分子的突然释放，并促进材料表面的内皮化。Mohammadi等人[14]将肝素/壳聚糖纳米粒子引入阳极氧化NiTi合金表面，证明纳米涂层可通过控制生物分子释放改善表面血液相容性和内皮细胞相容性。在我们之前的研究中，我们构建了一种用于支架表面修饰的新型肝素/聚赖氨酸纳米颗粒。我们证明了这种纳米涂层可以有效抑制血液凝固，减少再狭窄的发生[15，16］．然而，高分子量聚赖氨酸的一些缺陷如内皮细胞相容性差、细胞毒性显著等仍有待解决。

本研究设计了一种负载神经生长因子(NGF)的新型肝素/壳聚糖纳米颗粒用于心血管材料的表面改性。壳聚糖(CHS)是一种天然多阳离子多糖，具有良好的抗菌作用，促进损伤修复，减少炎症反应。此外，CHS还具有生物相容性、生物降解性、易化学修饰等显著优点，是最常用的药物载体之一[17，18］．NGF是一种重要的神经营养因子，对维持血管内皮组织的正常功能起着重要作用[19］．研究表明NGF可以促进血管内皮祖细胞(EPCs)的动员和归巢，显示出加速血管内皮损伤修复的潜力[20.，21］．NGF也是一种肝素结合蛋白;本研究通过NGF与肝素的特异性相互作用，将NGF装入肝素/壳聚糖纳米颗粒中，提高细胞相容性，加速内皮化。根据一系列的材料表征，在体外血液相容性和细胞相容性评价，本研究证明纳米颗粒的表面改性可以有效提高材料的抗凝血性能，加速内皮细胞再生。

2.材料和方法

2.1.材料和试剂

316L不锈钢(316L SS)加工成圆形(Φ10毫米，~1.2毫米厚)和镜面抛光。多巴胺(DA)、甲苯胺蓝O (TBO)和肝素(Hep)购自Sigma-Aldrich。壳聚糖(CHS, )，罗丹明123、阿利新蓝购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

2.2.CHS /玫瑰Nanocoating建设

首先将一定量的CHS和Hep粉溶解在0.1 M醋酸/醋酸钠缓冲液中( )，分别。然后在室温下磁搅拌，滴加等体积CHS至Hep溶液中(浓度比1 mg/ml: 7.5 mg/ml)，得到CHS/Hep纳米颗粒混悬液。对于CHS/Hep@NGF纳米颗粒制备，首先将15 mg/ml Hep与等体积的200 ng/ml NGF溶液混合，得到Hep@NGF混合物。在316L SS(称为SS- da)表面制备聚多巴胺涂层，根据我们之前工作中描述的方法[16］．之后，将SS-DA浸入0.5 ml CHS/Hep或CHS/Hep@NGF纳米颗粒悬液中，在室温下轻轻摇动12 h，获得纳米涂层(命名为SS-DA- np或SS-DA-NP@NGF)。

2.3.大小和Zeta电位测定

通过动态光散射(DLS)，使用zeta - sizer、MALVERN Nano-2S90 (MALVERN Ltd.， MALVERN, UK)测定制备的纳米颗粒的平均尺寸、粒子分散指数(PDI)以及zeta电位。

2.4.FTIR和XPS测定

利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和x射线光电子能谱(XPS)检测纳米粒子固定过程中表面化学结构和元素组成的变化。采用衰减全反射模型，在Nicolet IS20红外光谱仪(Thermo, USA)上进行FTIR分析。红外吸附在4000 ~ 650 cm之间⁻¹在室温下记录。XPS分析采用VGESCALAB MK II光谱仪，单色Mg Ka x射线源(1253.6 eV)。试验室压力设为 ．通过调整284.6 eV处的C1s峰值来参考结合能的规模。

2.5.AFM分析

利用原子力显微镜(AFM) (CSPM 6000，北京纳米仪器有限公司)在室温下攻丝模型中测定NP修饰后的表面形貌变化，随后使用CSPM Imager软件进行图像分析。AFM分析前，样品用UP水冲洗两次，表面小心吹干。

2.6.水接触角测定法

样品的亲水性是通过在室温下使用Krüss GmbH DSA100 Mk 2测角仪测量静态水接触角来确定的。在干燥的表面加入一液滴UP水，利用DSA 1.8软件的圆分段函数计算接触角。每个样本至少要测量三个不同的地点。

2.7.肝素和胺基的定量表征

分别用酸性橙ⅱ(AO II)法和TBO法测定暴露胺基和肝素浓度。具体方法参照我们之前的研究[16］．

2.8.体外血液相容性评价

取自健康志愿者的新鲜全血在9:1用柠檬酸钠(3.8 wt.%)抗凝，并在1500 rpm离心15分钟，以获得富血小板血浆(PRP)。接下来,50μl在每个样品表面加入PRP, 37℃孵育2 h。然后用生理盐水轻轻冲洗标本，用于形态学观察、乳酸脱氢酶(LDH)释放和p -选择素表达测定。具体方法参照我们之前的研究[15］．

2.9.体外细胞相容性评价

2.9.1.EC和SMC增殖试验

从人脐静脉中分离出内皮细胞，在含15%胎牛血清(FBS)和20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中培养μg/ml内皮细胞生长补充剂(ECGS)。平滑肌细胞(SMCs)从人脐动脉分离，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(高葡萄糖)中培养。在细胞播种前，用高压灭菌法对被多巴胺包裹的样品进行灭菌，随后在无菌条件下进行纳米涂层的构建。

在细胞增殖试验中，将ECs或smc以 细胞/厘米²在37°C, 5% CO下培养₂1天和3天。在每个时间点，清除上清，500μl加入含10% CCK-8试剂的新鲜培养基，孵育4 h。然后,200年μ将L培养基转移到96孔板上，在450nm处测定吸光度。用生理盐水轻轻冲洗，在2.5%戊二醛中室温固定至少6小时。随后,50μ在每个样品表面加入L罗丹明123溶液，室温孵育30分钟。最后用生理盐水彻底冲洗，倒置荧光显微镜观察上皮细胞的形态。

2.9.2.EPC动员和归航

Liu等人采用transwell室法在体外研究了纳米颗粒涂层诱导EPCs在材料表面的动员和归巢行为。[22］．具体来说，3毫升新鲜培养基(α在6孔板中加入含10% FBS的-MEM培养基，然后加入2 ml密度为 细胞/ml添加到6孔Millipore transwell室，底膜孔径为8μm.在37°C孵育2小时后，无菌样品的大小为 在6孔板培养基中浸泡，37°C培养24小时。之后，transwell室用生理盐水轻轻冲洗，然后室温下在90%乙醇溶液中固定30分钟。用湿棉签擦拭箱体上层的细胞，将箱体置于0.1%结晶紫溶液中，室温下染色15分钟。倒置显微镜下观察细胞在腔室下层的活动情况。

2.10.统计分析

所有的生物实验都至少进行了三次。统计数据采用SPSS 22.0软件进行分析。采用单因素方差分析对数据进行统计评价。的概率值 被认为是显著的。

3.结果与讨论

3.1.核粒子的大小和Zeta势

如表所示1， CHS的平均粒径/Hep@NGF ( )与CHS/Hep ( )，说明NGF的加入可以增强纳米颗粒的致密性。CHS/Hep和CHS/Hep@NGF的zeta电位绝对值均大于20 mV，说明颗粒体系具有足够的稳定性，避免了颗粒团聚引起的沉降。此外，CHS/Hep和CHS/Hep@NGF的颗粒分散指数(PDI)均小于0.2，表明制备的纳米颗粒具有良好的粒径均匀性。

3.2.FTIR和XPS

本文采用FTIR和XPS技术检测了NPs固定前后材料表面化学基团和元素组成的变化。如图所示1(一)，峰值在1600厘米处^－1在SS-DA谱中代表了苯环的C=C键，峰在1502 cm处^－1代表了苯环的键。CHS/Hep np改性样品的红外光谱出现了新的吸收峰。其中，最高峰在1630厘米^－1和1520厘米^－1为酰胺I带和酰胺II带的拉伸振动。这些峰主要来自壳聚糖分子中的酰胺和胺。此外，在1062 cm处可以观察到C-O-C键的振动峰^－1，说明肝素的存在。

根据XPS结果(图1 (b))，发现在SS-DA-NP和SS-DA-NP@NGF的光谱中可以观察到S2s和S2p的吸收峰，说明肝素的存在。元素计算结果(表2)进一步证明了NGF的加入可以显著提高N元素含量，而S元素含量的降低可能与NGF与Hep相互作用产生的空间屏蔽效应有关。综上所述，上述结果表明CHS/Hep和CHS/Hep@NGF NPs成功地固定在了材料表面。

3.3.np修饰表面的形貌

用AFM检测了不同样品的表面形貌变化。如图所示2SS-DA表面可见少量颗粒，可能是多巴胺聚合过程中产生的。经CHS/Hep和CHS/Hep@NGF NPs修饰的样品表面出现大量的纳米颗粒，其粒径范围在100 ~ 200 nm之间，与粒径检测结果一致。此外，纳米颗粒在样品表面分布均匀，未发现明显的颗粒团聚现象。

3.4.表面亲水性表征结果

如图所示3(一个)与316L SS相比，SS- da的水接触角明显增大，这主要是由于多巴胺涂层中苯环的疏水结构。CHS/Hep纳米颗粒的固定化显著提高了表面亲水性，这主要是由于壳聚糖和肝素分子中含有丰富的亲水性基团，如氨基、羧基、羟基和磺酸基。纳米颗粒中NGF的加入使水接触角略有增加，这可能与蛋白质结构外疏水基团的暴露有关。

表面亲水性的改变可能改变蛋白质的吸附类型和构象，进而影响其生物相容性。一般情况下，表面具有较高的疏水性(水接触) )可能触发蛋白质的不可逆吸附，破坏其构象，而亲水性高的表面(水接触 )会在表面形成水膜，导致蛋白质解吸[23］．在本研究中，np修饰表面的水接触角在40°~ 60°范围内，这可能促进黏附血浆蛋白的吸附，从而增强细胞相容性。

3.5.肝素和胺基的定量表征

数字3 (b)为np修饰表面上肝素定量表征结果，以SS-DA为空白对照。根据计算，肝素在SS-DA-NP上的暴露密度为 ，而在SS-DA-NP@NGF-modified表面略有增加( )．这可能是由于NGF加入后氨基基团密度增加所致(图3 (c))，这可能有助于纳米粒子与多巴胺涂层的共价结合。

肝素是一种具有优良抗凝血性能的负电荷多糖。根据以往的研究，肝素暴露密度在3-7之间μ克/厘米²可能有助于改善材料表面的血液相容性，防止炎症反应的发生，促进内皮层的愈合[15］．

3.6.体外血液相容性评价

数字4(一)显示血小板在体外粘附材料表面2小时的荧光染色结果。结果显示，316L SS和SS- da表面可见大量血小板，粘附的血小板聚集严重，说明激活严重，血液相容性差。相比之下，血小板在SS-DA-NP和SS-DA-NP@NGF表面的粘附密度大大降低，粘附血小板主要呈圆形，几乎没有变形和伪足，说明纳米颗粒能有效降低血小板的活化，改善血液相容性。LDH释放的结果(图4 (b))和p选择素的表达(图4 (c))进一步证明了CHS/Hep纳米粒子修饰的表面能显著降低血小板的粘附和活化( )．NGF的加入虽然在一定程度上增加了血小板粘附密度，但与316L SS和SS- da相比，NGF仍表现出优异的抗凝性能。

3.7.体外细胞相容性评价

数字5(一个)血管内皮细胞在不同样品表面培养一定时间后的荧光染色结果。结果表明，316L SS和SS- da在培养1、3 d后，表面贴壁内皮细胞呈现典型的鹅卵石状形态，说明细胞生物学功能正常。而在SS-DA-NP表面，ECs呈收缩或圆形形态，表明细胞粘附和增殖活性较差。SS-DA-NP@NGF表面内皮细胞形态正常，黏附密度与316L SS和SS- da相似。CCK-8结果(图5 (b))进一步证明SS-DA-NP表面细胞增殖活性明显降低，而SS-DA-NP@NGF表面细胞增殖活性无明显变化。

与ECs类似，与316L SS和SS- da相比，SMCs在SS- da - np表面的粘附密度和增殖活性明显降低(图5 (c)而且5 (d))．然而，虽然NGF的加入在一定程度上促进了SMCs扩散的粘附(图5 (c))，增殖活性显著降低( )与316L SS和SS- da相比(图5 (d))．

体外细胞相容性评价结果显示，CHS/Hep纳米颗粒修饰的表面不利于ECs和SMCs的粘附和生长，这主要与肝素分子对细胞增殖的抑制作用有关[24- - - - - -26］．NGF的引入在一定程度上改善了两种细胞的粘附和增殖行为，但不同细胞的增强程度不同。总的来说，SS-DA-NP@NGF表面表现出选择性促进内皮细胞生长和抑制平滑肌细胞增殖的作用。

3.8.EPC动员和归航

如图所示6， SS-DA-NP@NGF对transwell腔内的EPCs有显著的趋化作用。细胞培养24小时后，通过半透底膜到达腔底的EPCs数量明显高于SS-DA和SS-DA- np对照组。结晶紫染色结果显示，SS-DA-NP@NGF趋化EPCs表现出良好的增殖形态，细胞扩散和覆盖面积也明显高于对照组。结果表明，SS-DA-NP@NGF提供了足够的能力诱导EPCs的动员和归巢到材料表面。

综上所述，自从EPCs被发现以来，基于ECs从周围血管组织的迁移和EPC在损伤部位的归巢，血管内皮损伤愈合机制被重新定义[27］．虽然壳聚糖/肝素NPs修饰的表面具有良好的血液相容性和抑制平滑肌细胞生长的能力，但在促进内皮损伤修复方面仍存在不足的问题。NGF是一种生长因子，据报道可刺激HUVEC增殖并诱导EPC动员和归巢[21，28，29］．本研究发现，ngf负载的NPs可有效增强内皮细胞在样品表面的粘附和增殖活性，并对血管内皮细胞表现出较强的趋化作用，说明ngf负载的纳米涂层可选择性抑制血液凝固和内膜增生，同时加速内皮再生。

4.结论

本研究通过壳聚糖、肝素和层粘蛋白的静电相互作用，成功制备了CHS/Hep@NGF NPs，并将其固定在多巴胺包覆不锈钢表面。材料表征结果表明，纳米粒子均匀地固定在材料表面。生物学评价结果表明，修饰后的表面具有良好的抑制血小板粘附和激活的能力，有助于促进EC生长和防止SMC过度增殖。这项工作对无聚合物冠状动脉支架涂层的设计具有潜在的应用价值。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们对这项工作没有利益冲突。

作者的贡献

宋海鑫和吴涛对本研究贡献相同。

致谢

感谢浙江省自然科学基金(LQ20H170002)和国家自然科学基金(32071329)的资助。

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